豬肌肉堿性氨基酸和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體cDNA克隆及mRNA表達(dá)調(diào)控的研究.pdf

1、氨基酸和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)與肌肉生長(zhǎng)和肉質(zhì)形成有十分密切的聯(lián)系。氨基酸和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)的營(yíng)養(yǎng)底物是骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的重要組成部分，品種、日齡、肌肉特性和營(yíng)養(yǎng)等因素均可能使氨基酸和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)發(fā)生變化。為此，本論文開展了以下五個(gè)試驗(yàn)研究，旨在揭示豬骨骼肌部分氨基酸和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體發(fā)育性變化規(guī)律以及遺傳因素和營(yíng)養(yǎng)因素對(duì)其的影響，從而從分子水平探討藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬肌肉生長(zhǎng)發(fā)育差異和乳酸菌對(duì)肉質(zhì)產(chǎn)生影響的作用機(jī)制。
　　 試驗(yàn)一豬

2、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體GLUT-1的克隆
　　 試驗(yàn)以6日齡健康長(zhǎng)白豬骨骼肌為試驗(yàn)材料，成功克隆出豬葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體GLUT-1基因cDNA的部分序列，其長(zhǎng)度為792bp，與人和大鼠GLUT-1的cDNA序列比較發(fā)現(xiàn)同源性分別為92.7％和90.7％。
　　 試驗(yàn)二豬氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體CAT-2和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體GLUT-4的分子克隆
　　 試驗(yàn)采用RACE方法，根據(jù)GenBank中的公布序列或EST序列設(shè)計(jì)引物，以6日齡長(zhǎng)白豬

3、肌肉組織mRNA為模板，成功克隆豬氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體CAT-2和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體GLUT-4基因cDNA的全長(zhǎng)序列。結(jié)果表明：
　　 (1)豬CAT-2cDNA全長(zhǎng)3147bp，包含一個(gè)1974bp的ORF,5＇UTR(untranslatedregion)長(zhǎng)85bp,3＇UTR長(zhǎng)1087bp，編碼657個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)序列與堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)家族SLC7A2基因有很高的同源性，其和人CAT-2A、CAT-2B以及小鼠CAT-2A、C

4、AT-2B的同源性分別為91.3％、88.1％、92.1％和89.2％?？缒^(qū)分析顯示其有14個(gè)潛在的跨膜區(qū)，和其它物種的一致。
　　 (2)豬GLUT-4cDNA全長(zhǎng)2491bp，包含一個(gè)1530bp的ORF,5＇UTR長(zhǎng)34bp,3＇UTR長(zhǎng)927bp，和人、兔子以及牛的GLUT-4cDNA序列具有高度的同源性，尤其CDS區(qū)的同源性分別高達(dá)90.3％、90.3％和91.0％。CDS編碼509個(gè)氨基酸，豬GLUT-4氨基酸序列

5、與人、兔子以及小牛的GLUT-4氨基酸序列同源性分別為94.5％,95.1％和93.1％。跨膜區(qū)分析顯示其有12個(gè)潛在的跨膜區(qū)，和其它物種的一致。
　　 試驗(yàn)三豬葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體GLUT-1/4及堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體CAT-2mRNA表達(dá)的組織特異性
　　 采集初生雜交仔豬心、肝、肺、腸、腎、腦和骨骼肌肌肉組織樣品，提取組織樣品的總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，檢測(cè)豬GLUT-1/4及堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體CAT

6、-2在不同組織中的表達(dá)豐度。結(jié)果表明：
　　 (1)CAT-2在新生仔豬腦、肺、肝、腎、肌肉、腸、心都有一定的表達(dá)，而在心臟表達(dá)最高，其次是在肝、骨骼肌和肺，腦和腸道稍低，腎臟表達(dá)量最低。
　　 (2)GLUT-1在新生仔豬腦、肺、肝、腎、肌肉、腸、心都有一定的表達(dá)，而在心臟表達(dá)最高，其次是在肝、腎和腦組織，骨骼肌和腸道稍低，肺組織表達(dá)量最低。
　　 (2)GLUT-4在新生仔豬腦、肺、肝、腎、肌肉、腸、心都有一

7、定的表達(dá)，而在心臟表達(dá)最高，其次是在肝、骨骼肌和腦組織，在肺、腎和腸道等組織的表達(dá)量較低。
　　 試驗(yàn)四藍(lán)塘和長(zhǎng)白豬骨骼肌GLUT-1/4、IR和CAT-2 mRNA表達(dá)發(fā)育性變化比較
　　 分別采集1、7、26、30、60、90和150日齡的藍(lán)塘和長(zhǎng)白兩品種豬不同骨骼肌組織樣品，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，檢測(cè)豬GLUT-1/4及堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體CAT-2mRNA在不同骨骼肌中的表達(dá)模式。結(jié)果表明：
　　

8、 (1)1～150d藍(lán)塘和長(zhǎng)白豬背最長(zhǎng)肌、半膜肌和半腱肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體GLUT-1存在相似的發(fā)育變化規(guī)律，在1d時(shí)表達(dá)水平最高。60d時(shí)藍(lán)塘豬半膜肌GLUT-1mRNA表達(dá)豐度高于同日齡長(zhǎng)白豬(P＜0.10);150d時(shí)藍(lán)塘豬半腱肌GLUT-1mRNA表達(dá)豐度顯著高于同日齡長(zhǎng)白豬(P＜0.05)。
　　 (2)1～150d藍(lán)塘和長(zhǎng)白豬半膜肌和半腱肌GLUT-4mRNA相對(duì)表達(dá)豐度隨日齡呈波形式變化，變化速度和程度存在品種差異。

9、1d時(shí)藍(lán)塘豬背最長(zhǎng)肌GLUT-4mRNA表達(dá)豐度低于同日齡長(zhǎng)白豬(P＜0.10)，而在60d時(shí)顯著高于長(zhǎng)白豬(P＜0.05)；在7d和60d時(shí)藍(lán)塘豬半膜肌GLUT-4 mRNA表達(dá)豐度顯著高于同日齡長(zhǎng)白豬(P＜0.05);1d時(shí)藍(lán)塘豬半腱肌GLUT-4 mRNA表達(dá)豐度顯著低于同日齡長(zhǎng)白豬(P＜0.05)，而在其它日齡時(shí)有高于同日齡長(zhǎng)白豬的趨勢(shì)，其中150d時(shí)藍(lán)塘豬比長(zhǎng)白豬高48.14％(P＜0.10)。
　　 (3)藍(lán)塘豬和長(zhǎng)

10、白豬背最長(zhǎng)肌、半膜肌和半腱肌胰島素受體(IR)mRNA表達(dá)豐度在1d和30d時(shí)表現(xiàn)出較高水平，而在7d、60d、90d和150d時(shí)無明顯差異；同日齡藍(lán)塘和長(zhǎng)白豬之間無顯著性差異。
　　 (4)藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬背最長(zhǎng)肌、半膜肌和半腱肌CAT-2 mRNA表達(dá)水平從出生1d時(shí)開始逐漸上升，在90d時(shí)達(dá)到最大值，且顯著高于其它日齡，隨后表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。
　　 試驗(yàn)五植物源性乳酸菌對(duì)長(zhǎng)×大肥育豬骨骼肌葡萄糖和堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mR

11、NA表達(dá)的影響
　　 試驗(yàn)選用體重58kg左右的長(zhǎng)×大二元雜交閹公豬54頭，隨機(jī)分為兩個(gè)處理，即對(duì)照組(A組)和乳酸菌組（B組），每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)9頭。于試驗(yàn)結(jié)束時(shí)從每個(gè)重復(fù)選取2頭接近平均體重的閹公豬進(jìn)行放血屠宰。宰后2h內(nèi)，按解剖學(xué)位置分別從背最長(zhǎng)肌胸腰結(jié)合處、半腱肌中段和腰大肌中段采取組織樣品，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，檢測(cè)豬GLUT-1/4及堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體CAT-2mRNA在不同部位骨骼肌中的表達(dá)模

12、式。結(jié)果表明：
　　 (1)豬日糧中添加植物源性乳酸菌，對(duì)背最長(zhǎng)肌、半腱肌和腰大肌總糖原含量無顯著影響，但有提高背最長(zhǎng)肌PG含量趨勢(shì)(P＜0.10)。
　　 (2)在豬背最長(zhǎng)肌、半腱肌和腰大肌中，以腰大肌GLUT-1/4和IR mRNA表達(dá)水平最高；豬日糧中添加植物源性乳酸菌，對(duì)背最長(zhǎng)肌、半腱肌和腰大肌GLUT-1/4以及IR mRNA相對(duì)表達(dá)豐度無顯著影響。
　　 (3)豬日糧中添加植物源性乳酸菌，對(duì)豬背最長(zhǎng)肌

13、、半腱肌和腰大肌CAT-2mRNA表達(dá)豐度無顯著影響，但有降低腰大肌CAT-2表達(dá)水平趨勢(shì)。研究主要結(jié)論
　　 (1)豬葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體GLUT-1基因cDNA的部分序列，與人和大鼠同源性分別為92.7％和90.7％。豬CAT-2 cDNA與堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)家族SLC7A2基因有很高的同源性，其和人CAT-2A、CAT-2B以及小鼠CAT-2A、CAT-2B的同源性達(dá)91.3％、88.1％、92.1％和89.2％。14個(gè)潛在的跨膜區(qū)

14、，和其它物種的一致。豬GLUT-4cDNA和人、兔子以及牛的GLUT-4cDNA序列具有高度的同源性。12個(gè)潛在的跨膜區(qū)，和其它物種的一致。
　　 (2)CAT-2 mRNA、 GLUT-1 mRNA和GLUT-4 mRNA均在新生仔豬心臟表達(dá)最高。
　　 (3)藍(lán)塘豬和長(zhǎng)白豬背最長(zhǎng)肌、半膜肌和半腱肌中GLUT-4 mRNA表達(dá)水平明顯高于GLUT-1；長(zhǎng)白豬骨骼肌CAT-2 mRNA表達(dá)量最大值出現(xiàn)在90～150日齡期