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文檔簡介
1、我國是養(yǎng)禽大國且產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速,而疾病是限制養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一個重要因素。長期以來,疾病的控制主要依賴疫苗,由于病原微生物的變異及毒力的不斷增強(qiáng)等原因,使得疫苗使用效果不斷下降。因此,研究者開始轉(zhuǎn)向抗病育種研究,期望能從遺傳上提高家禽的抗病能力。研究表明,在家禽中MHC(major histocompatibility complex,主要組織相容性復(fù)合體)基因與多種疾病的抗性存在高度相關(guān)性,是家禽抗病育種研究中的優(yōu)選標(biāo)記基因。在雞上,位于M
2、HC基因核心位置的TAP1基因(Transporter associated antigen processing,抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運體),是編碼一類在內(nèi)源性抗原的呈遞過程中起著重要作用的轉(zhuǎn)運蛋白的基因,與抗病性、先天免疫應(yīng)答及經(jīng)濟(jì)性狀間具有相關(guān)性。本研究以29個中國地方雞種和國外雞種為研究對象,研究不同雞種TAP1基因多態(tài)性,對這些雞種進(jìn)行單倍型判定;并對廣西黃雞感染腸炎沙門氏菌后的TAP1表達(dá)量變化及不同單倍型個體TAP1表達(dá)規(guī)律進(jìn)行
3、研究,主要結(jié)果如下:
1.為了研究TAP1基因的多態(tài)性,本研究選取國內(nèi)外29個雞種,每個雞種以10個個體的DNA混池對TAP1基因進(jìn)行目標(biāo)捕獲測序,測序結(jié)果與NCBI中參考序列(登錄號:427727)比較后發(fā)現(xiàn):在TAP1基因外顯子上,青腳麻雞是存在SNP最多的品種,文昌雞只存在1個SNP,而如皋黃雞,雪山雞和太湖雞不存在SNP。同時,研究發(fā)現(xiàn)國外雞種,如羅斯雞,隱性白羽雞,安卡雞和AA雞的TAP1基因SNP突變數(shù)量較地方雞種
4、少;國外品種的INDEL突變也相對較少。在TAP1基因內(nèi)含子上,烏骨雞、SPF雞、雪山雞、藏雞和雜交雞所含SNP數(shù)量較多,廣西黃雞和綠殼蛋雞所含INDEL數(shù)量較多;國內(nèi)外品種比較發(fā)現(xiàn),國外雞種所含突變數(shù)量亦較國內(nèi)地方品種少。在TAP1基因啟動子上,在斗雞、固始雞、蕭山雞、鹿苑雞和斗雞雜交品種在67309位置存在10 bp的缺失,而綠殼蛋雞在此出現(xiàn)了20 bp缺失,出現(xiàn)缺失突變的均為國內(nèi)地方品種。以上結(jié)果表明我國地方雞種TAP1基因在外顯
5、子和啟動子區(qū)具有豐富的遺傳多樣性,TAP1基因可作為先天免疫研究的候選基因。
2.根據(jù)TAP1基因啟動子多態(tài)性重點對廣西黃雞進(jìn)行不同單倍型篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TAP1基因啟動子同樣存在1個10 bp的缺失,廣西黃雞中存在AA、AB和BB3種基因型;野生等位基因(與參考序列中紅色原雞一致)與突變等位基因頻率分別為0.847、0.153,PIC為0.239,平均雜合度為0.278,經(jīng)卡方適合性檢驗,廣西黃雞群體中TAP1基因處于Hard
6、y-Weinberg平衡狀態(tài)。經(jīng)JASPAR數(shù)據(jù)庫預(yù)測,TAP1基因啟動子10bp缺失區(qū)域可能存在3個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。
3.1日齡廣西黃雞感染腸炎沙門氏菌后0-21 dpi(day-po st-infection)盲腸載菌量結(jié)果表明,攻毒組沙門氏菌載菌量5d最高,2h到5d載菌量逐漸升高,5d到21d逐漸降低。血漿中細(xì)胞因子水平變化結(jié)果表明,對照組與攻毒組細(xì)胞因子濃度峰值出現(xiàn)時間點不同。IL-1α、IFN-γ濃度在對照組都是
7、在24 h達(dá)到最大值,而攻毒組則是4h時最大值。IgY濃度在對照組24 h達(dá)到第一個峰值,在攻毒組則持續(xù)緩慢上升。IgM濃度在對照組變化不明顯,在攻毒組,細(xì)胞因子IgM濃度在2h快速升高到最大值,2h到4h濃度又快速下降,4h之后濃度緩慢下降;表明廣西黃雞早期免疫反應(yīng)迅速,2h-4h屬于急性反應(yīng)期,5d后屬于免疫相對穩(wěn)定期。
4.通過QRT-PCR方法檢測1日齡廣西黃雞感染腸炎沙門氏菌后0-21 dpi TAP1基因mRNA表
8、達(dá)水平變化,結(jié)果表明,TAP1在心臟、肝臟、胸腺、法氏囊四個不同組織中廣泛表達(dá),但胸腺和法氏囊中整體表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05)。感染組和對照組TAP1基因表達(dá)量,感染組基因顯著表達(dá)高于對照組(P<0.05)。對照組TAP1基因表達(dá)量隨日齡增加而增加,在3 dpi的表達(dá)量顯著升高,表明3d是免疫狀態(tài)切換的關(guān)鍵時期。對于不同感染時間TAP1表達(dá)水平比較,不同組織在3 dpi表達(dá)量均最高,在1 dpi的表達(dá)量顯著升高,3 dpi之
9、后表達(dá)量下降,進(jìn)一步說明沙門氏菌感染后能引起雞只迅速產(chǎn)生免疫反應(yīng),且TAP1基因確實參與廣西黃雞的各種免疫反應(yīng)。
5.采用QRT-PCR方法檢測廣西黃雞中突變型和野生型個體的TAP1 mRNA表達(dá)水平變化,在對照組中同一組織中,突變型與野生型個體在不同時間點的TAP1表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。在攻毒組中,突變型與對照組野生型個體TAP1表達(dá)量也存在同樣趨勢,表明TAP1啟動子區(qū)在67309位置10bp的缺失突變對TAP
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