雞TAP1基因多態(tài)性及其在先天免疫中mRNA表達(dá)規(guī)律研究.pdf

1、我國是養(yǎng)禽大國且產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，而疾病是限制養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一個重要因素。長期以來，疾病的控制主要依賴疫苗，由于病原微生物的變異及毒力的不斷增強(qiáng)等原因，使得疫苗使用效果不斷下降。因此，研究者開始轉(zhuǎn)向抗病育種研究，期望能從遺傳上提高家禽的抗病能力。研究表明，在家禽中MHC(major histocompatibility complex，主要組織相容性復(fù)合體)基因與多種疾病的抗性存在高度相關(guān)性，是家禽抗病育種研究中的優(yōu)選標(biāo)記基因。在雞上，位于M

2、HC基因核心位置的TAP1基因(Transporter associated antigen processing，抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運體)，是編碼一類在內(nèi)源性抗原的呈遞過程中起著重要作用的轉(zhuǎn)運蛋白的基因，與抗病性、先天免疫應(yīng)答及經(jīng)濟(jì)性狀間具有相關(guān)性。本研究以29個中國地方雞種和國外雞種為研究對象，研究不同雞種TAP1基因多態(tài)性，對這些雞種進(jìn)行單倍型判定;并對廣西黃雞感染腸炎沙門氏菌后的TAP1表達(dá)量變化及不同單倍型個體TAP1表達(dá)規(guī)律進(jìn)行

3、研究，主要結(jié)果如下:
　　1.為了研究TAP1基因的多態(tài)性，本研究選取國內(nèi)外29個雞種，每個雞種以10個個體的DNA混池對TAP1基因進(jìn)行目標(biāo)捕獲測序，測序結(jié)果與NCBI中參考序列(登錄號:427727)比較后發(fā)現(xiàn):在TAP1基因外顯子上，青腳麻雞是存在SNP最多的品種，文昌雞只存在1個SNP，而如皋黃雞，雪山雞和太湖雞不存在SNP。同時，研究發(fā)現(xiàn)國外雞種，如羅斯雞，隱性白羽雞，安卡雞和AA雞的TAP1基因SNP突變數(shù)量較地方雞種

4、少;國外品種的INDEL突變也相對較少。在TAP1基因內(nèi)含子上，烏骨雞、SPF雞、雪山雞、藏雞和雜交雞所含SNP數(shù)量較多，廣西黃雞和綠殼蛋雞所含INDEL數(shù)量較多;國內(nèi)外品種比較發(fā)現(xiàn)，國外雞種所含突變數(shù)量亦較國內(nèi)地方品種少。在TAP1基因啟動子上，在斗雞、固始雞、蕭山雞、鹿苑雞和斗雞雜交品種在67309位置存在10 bp的缺失，而綠殼蛋雞在此出現(xiàn)了20 bp缺失，出現(xiàn)缺失突變的均為國內(nèi)地方品種。以上結(jié)果表明我國地方雞種TAP1基因在外顯

5、子和啟動子區(qū)具有豐富的遺傳多樣性，TAP1基因可作為先天免疫研究的候選基因。
　　2.根據(jù)TAP1基因啟動子多態(tài)性重點對廣西黃雞進(jìn)行不同單倍型篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TAP1基因啟動子同樣存在1個10 bp的缺失，廣西黃雞中存在AA、AB和BB3種基因型;野生等位基因（與參考序列中紅色原雞一致）與突變等位基因頻率分別為0.847、0.153，PIC為0.239，平均雜合度為0.278，經(jīng)卡方適合性檢驗，廣西黃雞群體中TAP1基因處于Hard

6、y-Weinberg平衡狀態(tài)。經(jīng)JASPAR數(shù)據(jù)庫預(yù)測，TAP1基因啟動子10bp缺失區(qū)域可能存在3個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。
　　3.1日齡廣西黃雞感染腸炎沙門氏菌后0-21 dpi(day-po st-infection)盲腸載菌量結(jié)果表明，攻毒組沙門氏菌載菌量5d最高，2h到5d載菌量逐漸升高，5d到21d逐漸降低。血漿中細(xì)胞因子水平變化結(jié)果表明，對照組與攻毒組細(xì)胞因子濃度峰值出現(xiàn)時間點不同。IL-1α、IFN-γ濃度在對照組都是

7、在24 h達(dá)到最大值，而攻毒組則是4h時最大值。IgY濃度在對照組24 h達(dá)到第一個峰值，在攻毒組則持續(xù)緩慢上升。IgM濃度在對照組變化不明顯，在攻毒組，細(xì)胞因子IgM濃度在2h快速升高到最大值，2h到4h濃度又快速下降，4h之后濃度緩慢下降;表明廣西黃雞早期免疫反應(yīng)迅速，2h-4h屬于急性反應(yīng)期，5d后屬于免疫相對穩(wěn)定期。
　　4.通過QRT-PCR方法檢測1日齡廣西黃雞感染腸炎沙門氏菌后0-21 dpi TAP1基因mRNA表

8、達(dá)水平變化，結(jié)果表明，TAP1在心臟、肝臟、胸腺、法氏囊四個不同組織中廣泛表達(dá)，但胸腺和法氏囊中整體表達(dá)量顯著高于其他組織(P＜0.05)。感染組和對照組TAP1基因表達(dá)量，感染組基因顯著表達(dá)高于對照組(P＜0.05）。對照組TAP1基因表達(dá)量隨日齡增加而增加，在3 dpi的表達(dá)量顯著升高，表明3d是免疫狀態(tài)切換的關(guān)鍵時期。對于不同感染時間TAP1表達(dá)水平比較，不同組織在3 dpi表達(dá)量均最高，在1 dpi的表達(dá)量顯著升高，3 dpi之

9、后表達(dá)量下降，進(jìn)一步說明沙門氏菌感染后能引起雞只迅速產(chǎn)生免疫反應(yīng)，且TAP1基因確實參與廣西黃雞的各種免疫反應(yīng)。
　　5.采用QRT-PCR方法檢測廣西黃雞中突變型和野生型個體的TAP1 mRNA表達(dá)水平變化，在對照組中同一組織中，突變型與野生型個體在不同時間點的TAP1表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05）。在攻毒組中，突變型與對照組野生型個體TAP1表達(dá)量也存在同樣趨勢，表明TAP1啟動子區(qū)在67309位置10bp的缺失突變對TAP