雞RNF11基因的克隆及對先天免疫中相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、先天免疫是生物體在發(fā)育的長期過程中建立起來的一系列天然保護(hù)能力，它提供了一種可以迅速阻礙病毒感染和傳播的屏障。環(huán)指蛋白11(RNF11)為RING-finger(Really Interesting New Gene)家族成員之一，屬于E3泛素連接酶家族成員，在人的抗病毒通路中發(fā)揮著重要的作用，RNF11是否也在雞的免疫抗病毒過程發(fā)揮相同的作用，參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，目前還沒有相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)首先通過克隆雞RNF11基因CDS區(qū)，并進(jìn)行序

2、列分析和蛋白相關(guān)特性的預(yù)測;其次對1日齡SPF雞腹腔注射禽白血病病毒(ALV-J)，利用定量PCR技術(shù)檢測RNF11以及干擾素IFN-α和IFN-β基因在14、21、28和35日齡雞法氏囊、脾臟和胸腺中的表達(dá);最后，通過構(gòu)建RNF11基因的過表達(dá)載體和干擾載體并轉(zhuǎn)染到雞成纖維細(xì)胞，分析轉(zhuǎn)染后的24和28小時(shí)(hps)，RNF11對IFN-β基因表達(dá)的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證RNF11在雞抗病毒通路上的作用，進(jìn)一步檢測炎性因子IL2和IL10基因

3、的表達(dá)，初步探討RNF11對炎癥反應(yīng)的影響。試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1)通過分析克隆所得雞RNF1基因的CDS區(qū)序列，得到了一段長度為465bp，共編碼154個(gè)氨基酸的序列。蛋白分析發(fā)現(xiàn)，其為非跨膜的疏水性蛋白，蛋白分子量為17.4156kDa，共有9個(gè)磷酸化位點(diǎn)，屬于RING-finger(Really Interesting New Gene)家族，可能參與細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的泛素化作用。
　　2)禽白血病感染1日齡的SPF雞

4、后，在法氏囊、脾臟和胸腺三個(gè)組織中，ALV-J基因的表達(dá)量在21日齡時(shí)最高，病毒復(fù)制的拷貝量最大，且表達(dá)趨勢基本一致。在法氏囊中，ALV-J引起RNF11，IFN-α和IFN-β基因的表達(dá)量在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)都顯著(p＜0.05)或者極顯著(p＜0.01)的上調(diào);在脾臟中，RNF11基因的表達(dá)量在14和21日齡時(shí)極顯著(p＜0.01)升高，但在35日齡差異不顯著，除IFN-β在21日齡時(shí)表達(dá)差異不顯著外，IFN-α和IFN-β基因的表達(dá)量都是

5、顯著或者極顯著高于對照組的;同樣在胸腺組織中，ALV-J誘導(dǎo)RNF11在14、21和28日齡顯著或極顯著表達(dá)，除IFN-β基因在35日齡表達(dá)差異不顯著外，IFN-α和IFN-β都是是顯著或者極顯著的高于對照。說明ALV-J可刺激機(jī)體干擾素基因表達(dá)的上調(diào)，引起了機(jī)體的抗病毒反應(yīng)，RNF11基因的表達(dá)升高，預(yù)示了其在雞機(jī)體內(nèi)的抗病毒通路上發(fā)揮著作用。
　　3)在ALV-J的刺激下，通過對雞成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染RNF11基因的過表達(dá)載體和干擾

6、載體，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)RNF11基因24和28小時(shí)(hps)后，IFN-β基因的表達(dá)量極顯著(p＜0.01)降低，而干擾RNF1基因表達(dá)后，IFN-β基因的表達(dá)量在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)都是極顯著高于對照組，結(jié)果證明了RNF11在雞成纖維細(xì)胞中下調(diào)干擾素物質(zhì)的產(chǎn)生，抑制抗病毒通路，在先天免疫中負(fù)調(diào)節(jié)通路。此外，過表達(dá)RNF11基因可上調(diào)炎癥因子IL2和IL10基因的表達(dá)，而干擾RNF11基因后，其表達(dá)量則顯著(p＜0.05)下降，初步揭示了RNF11基因