雞KLF15基因的組織表達(dá)特性及多態(tài)性分析研究.pdf

1、KLFs(Kruppel-like factor)是具有Cys2/His2鋅指DNA-蛋白結(jié)構(gòu)，屬于鋅指轉(zhuǎn)錄因子亞家族，參與多個(gè)細(xì)胞生理過程的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化等過程。KLF15作為KLF家族的重要成員同樣具有重要的生物學(xué)功能，前人研究表明，KLF15基因在骨骼肌的生長和脂肪代謝等方面具有重要的調(diào)控作用。本研究主要進(jìn)行了雞KLF15基因的組織表達(dá)規(guī)律研究，及其遺傳變異與固始雞x安卡雞F2代資源群經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)分析，并通過雙熒光素

2、酶報(bào)告系統(tǒng)對單核苷酸多態(tài)性(SNP)的功能進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　本試驗(yàn)利用熒光定量PCR技術(shù)對雞KLF15基因在固始雞不同時(shí)期不同組織中的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了探索。利用混合DNA池測序技術(shù)對該基因全序列進(jìn)行了SNPs掃描，共發(fā)現(xiàn)20個(gè)突變位點(diǎn)，其中18個(gè)位于內(nèi)含子，2個(gè)位于外顯子。經(jīng)過對所有SNPs進(jìn)行功能預(yù)測后，著重對內(nèi)含子2上的一個(gè)2-bp插入/缺失突變(G13781_13782 del/insAG)進(jìn)行了研究，通過PCR-RFLP技術(shù)

3、對固始雞x安卡雞F2代資源群個(gè)體進(jìn)行分型，并與資源群生長性狀、屠體性狀、肌纖維性狀和血液生化指標(biāo)等表型性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。利用淅川烏骨雞純系對該SNP位點(diǎn)進(jìn)行了群體驗(yàn)證，并通過熒光定量PCR技術(shù)分析了該SNP不同基因型的表達(dá)規(guī)律，最后利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)一步分析了該位點(diǎn)不同基因型是否能夠?qū)晒馑孛富钚援a(chǎn)生影響。主要結(jié)果如下:
　　1.選擇19種物種的KLF15基因的氨基酸序列進(jìn)行同源比對，發(fā)現(xiàn)19種物種共被分為兩大類:斑馬魚和

4、其他。在第二大類中，12種鳥類分為一類。在鳥類中，雞與原鴿和虎皮鸚鵡在一個(gè)層級，說明雞與二者進(jìn)化關(guān)系較近。從遺傳距離來看，雞與斑馬魚的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，與虎皮鸚鵡的親緣關(guān)系最近。
　　2.對固始雞1日齡和36周齡的胸肌、大腦、小腦、腎臟、腿肌、心臟、肺臟、脾臟、腺胃和肝臟等10種正常器官組織進(jìn)行了表達(dá)規(guī)律研究分析。相對定量的研究結(jié)果表明，在1日齡時(shí)，雞KLF15基因在肝臟中的相對表達(dá)量最高，在胸肌中的相對表達(dá)量最低;在36周齡時(shí)，在腺

5、胃中相對表達(dá)量最高，在胸肌中最低。
　　3.對于G13781_13782 del/insAG位點(diǎn)，計(jì)算其在F0、F1和F2代中等位基因頻率，結(jié)果表明在三個(gè)世代中insAG的頻率均高于delAG。通過混合線性模型計(jì)算該位點(diǎn)不同基因型與F2代資源群的表型性狀的關(guān)聯(lián)性，關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明該缺失突變與F2代資源群中體重、屠體重和脛長等生長性狀顯著相關(guān)(P＜0.05)。除初生重和0周齡脛長為delAG/delAG型大于insAG/insAG外

6、，其余關(guān)聯(lián)性狀均為ins AG/ins AG型具有最高值。該位點(diǎn)與肌纖維性狀和血液生化指標(biāo)等并不具有關(guān)聯(lián)性。
　　4.在淅川烏骨雞純系中，G13781_13782 del/insAG不同基因型與體重、脛長、脛圍等生長性狀關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果表明，該位點(diǎn)與骨盆寬顯著關(guān)聯(lián)(P＜0.05)，與其他性狀則并沒有表現(xiàn)出顯著關(guān)聯(lián)性。對于體重、脛長、龍骨長、骨盆寬等性狀，insAG/insAG基因型的值高于delAG/delAG。
　　5.通過

7、對不同基因型在F2代資源群雞肝臟中的表達(dá)規(guī)律分析，發(fā)現(xiàn)insAG/insAG型的相對表達(dá)量最高，insAG/delAG次之，delAG/delAG最低。構(gòu)建pGL3-Pro-del AG和pGL3-Pro-ins AG表達(dá)載體，利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對該缺失功能進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)果表明，對于DF1細(xì)胞，pGL3-Pro-delAG和pGL3-Pro-insAG熒光表達(dá)值均低于pGL-Pro載體，pGL3-Pro的表達(dá)值顯著高于pGL3

8、-Pro-insAG，pGL3-Pro-delAG和pGL3-Pro-insAG二者表達(dá)量并無顯著差異;對于Hela細(xì)胞，pGL3-Pro-delAG與pGL3-Pro熒光表達(dá)量并無顯著差異，但pGL3-Pro-insAG的熒光表達(dá)值則顯著高于pGL3-Pro-delAG與pGL3-Pro，為三者之中最高。
　　由以上試驗(yàn)結(jié)果，可得出如下結(jié)論:
　　1.雞KLF15基因在雞各組織中廣泛表達(dá)，不同時(shí)期呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，但均

9、在胸肌中表達(dá)最低。其內(nèi)含子2上的2-bp插入/缺失突變(G13781_13782 del/insAG)與雞的體重、脛長等生長性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，該位點(diǎn)可能與控制生長性狀的數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)或主效基因連鎖，可以考慮作為生長性狀選擇的分子標(biāo)記，且insAG/insAG為影響長速的基因型。
　　2.不同基因型表達(dá)規(guī)律分析結(jié)果表明不同基因型表達(dá)量存在差異，雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析結(jié)果表明兩種含有不同等位基因的表達(dá)載體在功能上存在一定