抗AKR1B10單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用.pdf

1、醛糖還原酶相似蛋白（AKR1B10，ARL-1）屬于醛酮還原酶超家族（AKRs），通過代謝醛、酮類產(chǎn)生醇發(fā)揮解毒功能。AKR1B10在許多正常組織中都不表達(dá)，但在肝臟低水平表達(dá)。已有報(bào)道，AKR1B10在非小細(xì)胞肺癌異常高表達(dá)，吸煙史與AKR1B10的表達(dá)有相關(guān)性，在乳腺癌、直腸結(jié)腸癌、宮頸癌和口腔癌等均發(fā)現(xiàn)AKR1B10高表達(dá)。目前關(guān)于AKR1B10與肝癌的關(guān)系報(bào)道很少。AKR1B10與多種腫瘤相關(guān)，但該分子表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系等

2、還有待進(jìn)一步深入研究。因此，制備高特異性抗AKR1B10單克隆抗體有重要意義。本實(shí)驗(yàn)室主要從事肝癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制研究，為了進(jìn)一步了解AKR1B10與肝癌的關(guān)系，制備并純化了抗AKR1B10的單克隆和多克隆抗體，并初步探討其應(yīng)用價(jià)值。 本研究通過原核表達(dá)并純化AKR1B10全長蛋白。用純化的AKR1B10-GST蛋白免疫新西蘭白兔，獲得多克隆抗體（PcAb），間接ELISA法測定多克隆抗體效價(jià)為1：96000。用純化的AKR1

3、B10-GST蛋白免疫Balb/c雌鼠，采用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體（McAb）。采用間接ELISA法對抗AKR1B10單克隆抗體進(jìn)行篩選，共獲得15株穩(wěn)定分泌抗AKR1B10抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1D2，1D6，1E4，2D8，3E2，4F8，5E3，5G12，10A2，1085，10D2，11B2，1287，12C3，12C12。制備并純化了5株抗AKR1B10單克隆抗體（1D6，1E4，2D8，5G12，10A2），經(jīng)鑒定

4、該5株抗AKR1B10單克隆抗體的Ig亞類均為IgG1，輕鏈屬于κ型。用Western blot對這些單克隆抗體進(jìn)行特異性鑒定，結(jié)果均與AKR1B10-GST。特異性結(jié)合，而與AKR1B1-GST和GST蛋白無交叉反應(yīng)。經(jīng)Western blot技術(shù)檢測10株肝癌及癌旁細(xì)胞系，AKR1B10在有相同來源的高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞系MHCC97H和低轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞系MHCC97L均高表達(dá)。提取24對肝癌及癌旁組織蛋白，Western blot檢測，6

5、2％（15/24）的肝癌組織存在AKR1B10的異常高表達(dá)。免疫組織化學(xué)法對9對肝癌組織切片染色，高、中、低分化程度的肝癌組織均存在AKR1B10蛋白的異常高表達(dá)。 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)獲得了高特異性抗AKR1B10的單克隆和多克隆抗體，初步應(yīng)用于肝癌組織和細(xì)胞的Western blot和免疫組織化學(xué)染色檢測，提示肝癌組織存在AKR1B10異常高表達(dá)，為進(jìn)一步擴(kuò)大臨床樣本，研究AKR1B10蛋白在肝癌組織中異常表達(dá)與肝癌分級、臨床分