抗AKR1B10單克隆抗體識(shí)別抗原位區(qū)段分析及初步應(yīng)用.pdf

1、醛糖還原酶相似蛋白(aldo-keto reductase family1 member B10,ARL-1,AKR1B10)是醛酮還原酶超家族(aldo-keto reductases,AKRs)成員分子。它以NADPH作為輔酶還原各種醛酮化合物為醇,發(fā)揮代謝作用,其作用底物廣泛,參與細(xì)胞多項(xiàng)生理代謝活動(dòng),包括代謝有害羰基化合物,清除體內(nèi)活性氧自由基,調(diào)節(jié)脂肪酸合成等。但是正常情況下其表達(dá)譜較窄,主要表達(dá)在人小腸、結(jié)腸、腎上腺等組織,

2、最近研究顯示其在正常肝臟組織中亦有較弱表達(dá),與之形成對(duì)比的是AKR1B10在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào),包括肺癌、肝癌、直腸結(jié)腸癌、乳腺癌、口腔癌和宮頸癌等,現(xiàn)己將其作為腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行研究。Heringlake最新研究顯示,AKR1B10的表達(dá)與原發(fā)性肝癌的分化程度具有相關(guān)性,在高、中分化肝癌中.AKR1B10表達(dá)上調(diào),但在低分化肝癌中AKR1B10表達(dá)下調(diào)。還有研究顯示暴露于香煙冷凝液等有害環(huán)境因素下的人正常肺上皮細(xì)胞和肺鱗狀腫瘤細(xì)胞均表

3、現(xiàn)出AKR1B10基因活化并表達(dá)上調(diào)。
　　 本研究前期克隆并表達(dá)了AKR1B10全長(zhǎng)融合蛋白并用它作為抗原免疫小鼠,獲得了15株單克隆抗體。由于是使用全長(zhǎng)蛋白作為抗原,所得抗體針對(duì)的抗原表位并不明確,本研究克隆表達(dá)截短AKR1B10蛋白,分析抗體所針對(duì)優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)段；另外AKR1B10在胃癌、食管癌中的表達(dá)未見(jiàn)報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)選用AKR1B10單克隆抗體1D6,利用免疫組織化學(xué)法(ABC法)對(duì)26例食管癌以及22例胃癌組織石蠟切

4、片標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)并結(jié)合腫瘤的臨床病理資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；本文還利用蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot,WB)檢測(cè)了MHCC-97H、MHCC-97L兩株肝癌細(xì)胞系培養(yǎng)上清中.AKR1B10的表達(dá)。結(jié)果如下：
　　 ⑴兩次克隆表達(dá)截短AKR1B10融合蛋白,第一次將全長(zhǎng)蛋白截為三段,得到GST-AKR1B10-1、GST-AKR1B10-2、GST-AKR1B10-3三個(gè)融合表達(dá)蛋白,間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)分析發(fā)現(xiàn)

5、15株單抗均識(shí)別GST-AKR1B10-2,在此實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上將第二段進(jìn)一步截短表達(dá),得到GST-AKR1B10-2-1、GST-AKR1B10-2-2兩個(gè)融合表達(dá)蛋白,ELISA分析發(fā)現(xiàn)14株單抗能同時(shí)識(shí)別兩段截短蛋白,1株單抗1287僅識(shí)別GST-AKR1B10-2-1,以上結(jié)果顯示AKR1B10優(yōu)勢(shì)抗原表位可能分布在GST-AKR1B10-2內(nèi),也就是全長(zhǎng)蛋白的105-205位氨基酸之間。
　　 ⑵用自制單克隆抗體1D6,通過(guò)

6、免疫組化方法檢測(cè)了22對(duì)胃癌和相應(yīng)癌旁組織AKR1B10表達(dá)情況,在31.8％(7／22)的胃癌組織標(biāo)本中AKR1B10的表達(dá)呈陽(yáng)性,在100％的癌旁正常組織中高表達(dá),且集中表達(dá)于胃黏膜上皮細(xì)胞。WB檢測(cè)胃永生化細(xì)胞系GES-1和胃癌細(xì)胞系BGC823、MKN45、SGC7901、MCG803,沒(méi)有檢測(cè)到AKR1B10的表達(dá)。
　　 ⑶用1D6抗體,通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)了26對(duì)食管癌和相應(yīng)癌旁組織AKR1B10表達(dá)情況,結(jié)果顯示

7、,AKR1B10在88.5％(23／26)的食管癌組織中呈陽(yáng)性表達(dá),在61.5％(16／26)癌旁組織中AKR1B10表達(dá)呈陽(yáng)性,且集中表達(dá)于食道黏膜上皮細(xì)胞；有65.4％(17／26)的食管癌組織標(biāo)本表達(dá)強(qiáng)于癌旁,統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)AKR1B10表達(dá)與食管癌病理分型和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)性沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。WB檢測(cè)胚胎食管永生化細(xì)胞系H5E46和食管癌細(xì)胞系Eca9706、CaEs17、SHEEC、KYSE-150中AKR1B10的表達(dá),結(jié)果顯示胚胎