載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖抑制作用.pdf

1、目的：構(gòu)建小干擾RNA(siRNA)表達(dá)質(zhì)粒，觀察質(zhì)粒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)能否有效的抑制A549細(xì)胞的增殖。 方法：針對(duì)表皮生長因子受體(EGFR)基因設(shè)計(jì)構(gòu)建4個(gè)可表達(dá)特異性siRNA的重組質(zhì)粒，利用核酸轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine<'TM>2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞中。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染分7組(pSilencer-1組、pSilencer-2組、pSilencer-3組、pSilencer-4組、p53-

2、pcDNA、脂質(zhì)體組及空白對(duì)照組)，采用四甲基偶氮唑鹽比色試驗(yàn)(MTT法)測定吸光度(A值)以觀察轉(zhuǎn)染后1、3、5、7日該細(xì)胞增殖的活力，并計(jì)算各組增殖抑制率。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染則利用潮霉素對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行加壓篩選，得到可以穩(wěn)定表達(dá)該重組質(zhì)粒的A549細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期分布情況，比較各組G0/G1期細(xì)胞百分比。 結(jié)果：1.成功構(gòu)建：EGFR基因的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，并通過瓊脂糖凝膠電泳以及基因測序證實(shí)序列的正確。2.pSi

3、lencer-1、pSilencer-2、pSilencer-3、pSilencer-4瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后均能引起細(xì)胞增殖活力的下降，與未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組相比，結(jié)果有顯著差異(p<0.05)，與單轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體組相比較，也有顯著性差異(p<0.05)，與陽性對(duì)照P53-pcDNA組差異無顯著性(p>0.05)；P53-pcDNA組與脂質(zhì)體組及空白對(duì)照組亦有顯著性差異(p<0.05)。而單轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體組與空白對(duì)照組相比較，差異無顯著性(p>

4、0.05)，且4個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間并無顯著性差異(p>0.05)。pSilencer-1組、pSilencer-2組、pSilencer-3組、pSilencer-4組在轉(zhuǎn)染后1、3、5、7天對(duì)細(xì)胞的增殖活力影響隨時(shí)間變化差異無顯著性(p>0.05)。3.pSilencer-1組、pSilencer-2組、pSilencer-3組、pSilence-4組及P53-pcDNA組在轉(zhuǎn)染后對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制率較脂質(zhì)體組顯著增加(p<0.05)

5、，但4個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間及與P53-pcDNA組之間差異無顯著性(p>O.05)，且隨轉(zhuǎn)染時(shí)間變化不明顯(p>0.05)。4．穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSilencer-1、pSilencer-2、pSilencer-3、pSilencer-4后G0／G1期細(xì)胞較空白對(duì)照組分別增加了29.03％、28.08％、18.65％、19.79％(p<0.05)，且pSilencer-1、pSilencer-2效果優(yōu)于pSilencer-3、pSilencer-4組(

6、p<0.05)。 結(jié)論：1．靶向EGFR的反向重復(fù)序列可插入pSilencer<'TM> 2.1-U6 hygro質(zhì)粒中，成功的構(gòu)建出在體內(nèi)可表達(dá)出siRNA的重組質(zhì)粒。2．靶向EGFR的siRNA表達(dá)質(zhì)?？赊D(zhuǎn)染A549細(xì)胞。3．siRNA表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，可有效地抑制細(xì)胞的增殖活力，在轉(zhuǎn)染后1、3、5、7天抑制率最高可達(dá)88.15％。4．穩(wěn)定轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)質(zhì)粒的A549細(xì)胞其細(xì)胞周期分布發(fā)生了明顯變化，有更多的