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文檔簡介
1、惡性腫瘤一直是嚴重危害人類健康和生命的重大疾患,而肺癌是世界范圍致死率最高的惡性腫瘤之一,因此揭示癌癥的發(fā)病機理,尋找遏制和治愈癌癥的方法是人們長期面臨的挑戰(zhàn)。在肺癌的治療中,藥物化療占據(jù)了非常重要的地位,而現(xiàn)有的化療藥物中均存在很大的毒副作用,因此,開發(fā)療效顯著、毒副作用小的新型化療藥物非常重要和迫切。
隨著腫瘤生物學的發(fā)展,人們對腫瘤生物特性的認識不斷深化。腫瘤細胞以無限增殖為主要特征,細胞增殖、細胞分化、凋亡、自噬等
2、過程均存在不同程度的調(diào)控異常,其中細胞周期調(diào)控異常是腫瘤發(fā)生發(fā)展中最基礎(chǔ)的機制。因此,針對調(diào)控這些過程的關(guān)鍵分子開發(fā)新型的化合物自然引起了人們的注意和廣泛研究。
細胞自噬是廣泛存在的一個進化保守的生物學過程,其在細胞應(yīng)對營養(yǎng)缺乏、細胞器或蛋白損傷及細胞分化、生長調(diào)控中均發(fā)揮了重要的作用。在腫瘤細胞中,自噬同樣發(fā)揮了重要作用,一方面其促進了腫瘤細胞在營養(yǎng)匱乏和抗癌治療的環(huán)境中存活下來,另一方面,過度自噬引起的自噬性死亡填補了
3、腫瘤細胞凋亡能力下降的缺陷。因此誘導腫瘤細胞自噬性死亡豐富了腫瘤的治療策略,引起了人們的關(guān)注。
一門新興的交叉學科——化學遺傳學在這一領(lǐng)域的研究中發(fā)揮了日新月異的作用?;瘜W遺傳學是一門應(yīng)用小分子化合物,對細胞內(nèi)的生物學過程進行干擾與調(diào)控,以此來研究細胞內(nèi)生物學過程,從而得到參與這些生物過程的關(guān)鍵分子及其作用機制的學科,同時其促進了新型藥物的篩選并深化了人們對小分子化合物在生物學上的構(gòu)效關(guān)系的認識。化學遺傳學已經(jīng)形成一套比較
4、成熟的技術(shù)平臺,在腫瘤機理的研究和新型抗癌藥物的開發(fā)中發(fā)揮了越來越重要的作用。
本研究利用化學遺傳學技術(shù)平臺,合成一系列小分子化合物,篩選出兩批能夠有效抑制人肺腺癌A549細胞生長的小分子化合物,并進一步初步研究了其作用機制。這些研究結(jié)果為尋找新型抗肺癌藥物提供一定的基礎(chǔ),也為深入認識小分子化合物在生物學上的構(gòu)效關(guān)系積累了數(shù)據(jù)。
研究方法:
1.人肺腺癌A549細胞的傳代培養(yǎng)
2.
5、倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化
3.SRB法檢測細胞存活率
4.Hoechst33258染色檢測細胞凋亡率
5.吖啶橙(AO)染色檢測細胞酸性膜泡的積累
6.westernblot檢測LC3-Ⅱ表達水平
7.乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測細胞是否發(fā)生壞死
8.細胞流式技術(shù)檢測周期
研究結(jié)果:
1.二茂鐵基吡唑β氨基醇衍生物對人
6、肺腺癌A549細胞生長抑制作用研究
1.1.SRB方法檢測結(jié)果表明,40μM的16種化合物處理A549細胞48小時后,與陰性對照組(100%)相比,細胞存活率均顯著下降。其中(R)-4a,(S)-4a,(R)-4b、(R)-4d,(S)-4d效應(yīng)明顯,以濃度依賴的方式降低A549細胞的存活率,其IC50值均在30μM左右。
1.2.觀察細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn),分別用5μM,10μM,20μM,40μM的上述5種化合物處
7、理A549細胞,與對照組相比,細胞數(shù)量以濃度和時間依賴的方式減少,但是細胞形態(tài)均無明顯變化,細胞形態(tài)保持完整,未見空泡化、凋亡小體等。
1.3.乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測表明,40μM的上述5種化合物分別處理A549細胞48h后,與對照組相比,LDH活性未發(fā)生明顯變化,這表明上述5種化合物不引起A549細胞的壞死。
1.4.Hoechst33258活染法檢測表明,5μM,10μM,20μM,40μM上述五種
8、化合物分別處理A549細胞48小時后,與對照組相比,未見明顯的核固縮、核破裂、核片段化等現(xiàn)象,表明上述五種化合物可能不是通過誘導凋亡來抑制A549細胞的生長。
1.5.吖啶橙染色法檢測表明,5μM,10μM,20μM,40μM的上述五種化合物分別處理A549細胞48小時后,與對照組相比,均未出現(xiàn)明顯酸性膜泡積累,初步表明化合物沒有引起A549細胞自噬性死亡。
1.6.細胞流式技術(shù)檢測表明,40μM的上述五種化
9、合物分別處理A549細胞48小時后,均顯著引起A549細胞G1期周期阻滯。
2.吡唑醇衍生物對人肺腺癌A549細胞的生長抑制作用的研究
2.1.SRB方法檢測結(jié)果表明,三種吡唑醇衍生物4d,4e,4f分別在60μM濃度下處理A549細胞48小時后,與陰性對照組相比,發(fā)現(xiàn)4d,4e導致細胞存活率均顯著下降至50%以下,而4f無顯著效果。
2.2.觀察細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn),上述三種化合物在60μM濃度下處理
10、A549細胞,與對照組相比,細胞數(shù)量明顯減少,但是細胞形態(tài)均未見明顯變化,細胞保持完整,未見空泡化、凋亡小體等。
2.3.乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測表明,60μM的上述3種化合物分別處理A549細胞48h后,與對照組相比,LDH活性未發(fā)生明顯變化,這表明上述3種化合物不引起A549細胞的壞死。
2.4.Hoechst33258活染法檢測表明,60μM上述3種化合物分別處理A549細胞48小時后,與對照組相比
11、,細胞核均呈暗藍色,未出現(xiàn)核凝集、核破碎或核邊緣化等凋亡特征,表明上述3種化合物可能不是通過誘導凋亡來抑制A549細胞的生長。
2.5.吖啶橙染色法檢測表明,60μM的上述3種化合物分別處理A549細胞48小時后,與對照組相比,4d,4e處理組酸性膜泡數(shù)量明顯增加,在細胞質(zhì)中呈彌散狀分布,而4f處理組酸性膜泡數(shù)量未見明顯增加,分布局限于核周圍,此結(jié)果初步表明化合物4d,4e導致A549細胞自噬,而4f不誘導自噬。
12、 2.6.westernblot法結(jié)果表明,上述三種化合物在60μM濃度下分別處理細胞48小時后,4e處理組中A549細胞LC3-Ⅱ表達量明顯上調(diào),4d,4f組A549細胞LC3-Ⅱ表達量變化不明顯,這進一步支持了化合物4d可以誘導A549細胞自噬的結(jié)論。
2.7.細胞流式技術(shù)檢測表明,60μM的上述3種化合物分別處理A549細胞48小時后,與對照組相比,4d,4e兩種化合物均顯著引起A549細胞G1期周期阻滯,而4f
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