新生大鼠常壓高氧性腦損傷的發(fā)病機制及NAC干預(yù)作用的實驗研究.pdf

1、目的: 1、建立正常新生大鼠高氧性腦損傷模型，結(jié)合神經(jīng)發(fā)育行為學(xué)方法研究高氧對新生大鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和遠期結(jié)構(gòu)、功能的影響； 2、動態(tài)觀察不同吸氧時間，新生大鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞的活化、TNF-αmRNA和蛋白、JNK磷酸化、NF-κB表達水平和腦細胞凋亡程度，結(jié)合高氧對腦組織氧化/抗氧化指標的影響，探討高氧對未成熟腦發(fā)育和腦損傷的影響及其機制； 3、以抗氧化劑NAC作為干預(yù)藥物，觀察NAC對常壓高氧性腦損傷的干預(yù)作用

2、及探討可能的作用機制。 本論文結(jié)構(gòu): 本課題主要分三部分進行研究和論述： 1、新生大鼠常壓高氧性腦損傷模型的建立。 2、氧化應(yīng)激損傷、促炎性細胞因子TNF-a、活化的小膠質(zhì)細胞、轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、JNK在高氧性腦損傷中的作用。 3、N-乙酰半胱氨酸對常壓高氧性腦損傷的干預(yù)作用。 第一章新生大鼠常壓高氧性腦損傷模型的建立 一、材料和方法:1、實驗動物和模型制備250-300g左右S

3、D大鼠，雌雄交配(4:1)，孕21-23d自然分娩的新生鼠中，取體重12～18g的7日齡新生鼠(雌雄不限)，隨機分為高氧模型組和空氣對照組。高氧組置于氧箱(有機玻璃箱)中，調(diào)節(jié)氧流量(3L/min)使箱內(nèi)氧濃度維持在(80.0±2.0)％，每日用數(shù)字式測氧儀進行監(jiān)測，箱內(nèi)放置鈉石灰吸收大鼠呼出的CO2，使其濃度低于0.5％。每天開箱1h，喂水及飼料，更換墊料，與空氣組互換母鼠以避免母鼠因氧中毒而影響哺乳?？諝饨M置于同一室內(nèi)空氣中，氧濃度

4、21.0％，飼養(yǎng)條件與高氧組相同。部分動物21日齡時斷奶，雌雄分籠并標準飼料喂養(yǎng)至37日齡，進行Morris水迷宮測試。 2、樣本獲取和指標觀察(1)以上兩組分別于生后8天(高氧/空氣暴露24小時)、10天(高氧/空氣暴露72小時)記錄新生大鼠死亡數(shù)目，并計算死亡率。觀察新生大鼠在高氧暴露后的一般狀態(tài)，記錄體重、腦重增長情況。 (2)空氣/高氧開始暴露30min后，各處死3只大鼠，行動脈血氣分析。 (3)空氣/高

5、氧開始暴露72h后，各處死10只大鼠，測量腦組織含水量。 (4)依高氧暴露時間分2h、6h、12h、24h、72h組，在高氧組各時間點，新生鼠分別于開始吸氧后24小時、72小時被處死，每組10只大鼠。空氣組新生鼠處死日齡與高氧組相同；空氣/高氧暴露72h組在生后15d、42d，完成神經(jīng)行為功能測試后，各處死10只大鼠。觀察新生鼠大腦病變：①HE染色觀察腦組織形態(tài)學(xué)改變及計算42日齡左腦海馬CA1區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)目。②免疫組織化學(xué)染

6、色觀察空氣/高氧暴露72h組生后10d、15d、42d腦組織MBP表達。③TUNEL(原位細胞凋亡檢測法)觀察高氧暴露2h、6h、12h、24h、72h、15d腦組織細胞凋亡指數(shù)。 (5)空氣/高氧暴露72h組生后8-15d、37-41d進行神經(jīng)行為功能檢測。 3、統(tǒng)計分析 所有實驗數(shù)據(jù)用Exce12003及SPSS10.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理。實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差“-x±s”表示。早期神經(jīng)行為異常發(fā)生率的比較用

7、卡方檢驗，水迷宮實驗組間穿環(huán)次數(shù)比較用秩和檢驗((kruskal-Wallis)，其余數(shù)據(jù)多組之間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩之間進一步比較用SNK-q檢驗，α=0.05為顯著性檢驗標準。 二、結(jié)果: 1、高氧對新生大鼠死亡率和一般狀態(tài)的影響兩組新生大鼠在空氣/高氧暴露吸氧24h、72h的死亡率均小于5％，兩組間差異無顯著性。在吸氧過程中、吸氧后均未出現(xiàn)驚厥、癱瘓等異常行為?？諝饨M活潑好動、反應(yīng)靈敏；高氧模

8、型組部分動物出現(xiàn)精神不振、呼吸促、懶動、肌張力低等現(xiàn)象，但在第2～3天后逐漸恢復(fù)正常。 2、高氧對新生大鼠動脈血氧分壓的影響空氣組平均PaO2為87±2.71mmHg，而高氧組為219±10.7mmHg，高氧組明顯高于空氣組(P<0.01)。 3、高氧對新生大鼠體重增長的影響兩組新生大鼠體重增長差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 4、高氧對新生大鼠腦重增長的影響高氧模型組各時間點新生大鼠腦重較空氣組相對輕，但差異

9、尚無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 5、高氧對新生大鼠腦含水量的影響高氧72小時組新生大鼠腦含水量為87.61±0.429％，空氣組為86.54±0.832％，兩組腦含水量有顯著性差異(P<0.05)。 6、腦組織形態(tài)學(xué)改變與評價 三、小結(jié): 1、常壓高濃度氧可以引起新生大鼠腦水腫和腦細胞的凋亡； 2、高氧可抑制腦組織MBP的表達，影響腦組織髓鞘化過程； 3、高濃度氧可影響新生大鼠神經(jīng)行為發(fā)

10、育，引起遠期學(xué)習(xí)、記憶功能的缺失。 第二章氧化應(yīng)激損傷、促炎性細胞因子TNF-a、活化的小膠質(zhì)細胞在高氧性腦損傷中的作用 一、材料和方法:1、實驗動物和模型制備同第一章2、樣本獲取和指標觀察(1)GSH、GSSG、GSH/GSSG、SOD、MDA檢測：取7日齡新生大鼠16只分別于高氧/空氣暴露)12h后即刻準確稱取大腦皮質(zhì)組織100mg，按說明書進行檢測。 (2)依高氧暴露時間分2h、6h、12h、24h，在高氧

11、組各時間點，新生鼠分別于開始吸氧后24小時、72小時被處死，每組10只大鼠，空氣組動物處死日齡與高氧組相同；空氣/高氧暴露72h組生后15d各處死10只大鼠。腦組織4％多聚甲醛灌注固定后，進行免疫組織化學(xué)染色觀察腦組織TNF-a、Caspase-3的表達水平，免疫熒光染色腦組織活化小膠質(zhì)細胞標記物ox-42的表達水平。 (3)高氧暴露后2h、6h、12h、24h各處死4只大鼠，取左腦組織提取RNA，RT-PCR檢測TNF-amR

12、NA，以β-actin為內(nèi)參，計算相對單位，并與空氣對照組比較；取右腦組織分別提取總蛋白和胞核蛋白，WesternBlot檢測腦組織JNK的表達及其磷酸化情況和NF-κB表達水平，以GAPDH蛋白為內(nèi)參照，并與空氣對照組進行比較。 3、統(tǒng)計分析: 實驗結(jié)果以均數(shù)士標準差“-x±s”表示，各組均數(shù)采用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩之間進一步比較用SNK-q檢驗，α=0.05為顯著性檢驗標準。 二、結(jié)果:

13、 1、高氧對腦組織氧化應(yīng)激指標的影響高氧可引起腦組織GSH、SOD水平下降，GSSG、GSSG/GSH、MDA水平升高 2、高氧對腦組織ox-42、TNF-a、caspase-3表達水平的影響隨著吸氧時間的延長，腦組織ox-42、TNF-a、Caspase-3的表達水平明顯升高，以12-24h達高峰，吸氧后8天降至空氣對照組水平(P>0.05)。 3、高氧對TNF-amRNA表達的影響隨著吸氧時間的延長，腦組織TNF-a

14、mRNA表達水平明顯升高，以12-24h達高峰，吸氧后8天降至空氣對照組水平(P>0.05)。 4、高氧對腦組織JNK、JNK磷酸化、NF-κB的影響隨著吸氧時間的延長，腦組織JNK磷酸化、NF-κB表達水平明顯升高，以12-24h達高峰；JNK的表達各時間點無明顯變化(P>0.05)，與空氣對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。 三、小結(jié): 1、高氧組動物腦組織GSH、SOD的水平下降，GSSG、GSSG/G

15、SH、MDA水平較空氣對照組高，說明高氧引起腦組織的氧化應(yīng)激及氧化損傷。 2、高氧可以增加腦組織caspase-3、ox-42、TNF-amRNA及蛋白的表達；他們的表達水平與高氧暴露時間有關(guān)，說明小膠質(zhì)細胞的活化、TNF-a介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與了高氧性腦損傷的過程。 3、高氧同時激活腦組織JNK、NF-κB的活化，兩者的活化水平也與高氧暴露時間相關(guān)。JNK、NF-κB通路活化可能介導(dǎo)小膠質(zhì)細胞的活化、TNF-a過表達。

16、 第三章N-乙酰半胱氨酸對常壓高氧性腦損傷的干預(yù)作用 一、材料和方法:1、實驗動物和模型制備實驗動物同前。高氧模型制備同第一章。吸氧時間因檢測指標不同而異。 2、樣本獲取和指標觀察2.1腦組織含水量變化空氣/高氧開始暴露后12h各處死10只大鼠，測量腦組織含水量。 3、統(tǒng)計方法同第一章 結(jié)論: 1、常壓高濃度氧可以引起新生大鼠腦細胞的凋亡，影響腦組織髓鞘化過程及神經(jīng)行為發(fā)育，導(dǎo)致遠期學(xué)習(xí)、記

17、憶功能的缺失。 2、高氧模型組動物腦組織GSH、SOD的水平較空氣對照組下降，GSSG、MDA水平較空氣對照組高。說明高氧引起腦組織的氧化應(yīng)激及氧化損傷，介導(dǎo)了高氧引起的腦細胞凋亡。 3、高氧可以誘導(dǎo)caspase-3、ox-42、TNF-amRNA及蛋白的表達，表達水平與高氧暴露時間有關(guān)，說明小膠質(zhì)細胞的活化、TNF-a介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能通過激活死亡信號通路參與了高氧性腦細胞的凋亡過程。 4、高氧同時激活腦組織