環(huán)磷腺苷葡胺和氨茶堿對(duì)新生大鼠缺血缺氧性腦損傷的干預(yù)作用.pdf

1、新生兒缺血缺氧性腦?。╤ypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是指各種圍生期窒息引起的部分或完全缺氧、腦血流減少或暫停而導(dǎo)致的胎兒或新生兒腦損傷。腦組織以水腫、壞死和凋亡為主要病變，輕者預(yù)后良好，重者引起新生兒死亡或遺留神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。HIE發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多個(gè)層次，單純的對(duì)癥支持治療不能從根本上改善患兒的腦損傷及遠(yuǎn)期預(yù)后，而目前的神經(jīng)保護(hù)療法也都處于探索階段，故尋找治療HIE更為有效的方法仍是國(guó)內(nèi)外研

2、究的重要課題。 HIE從損傷開始一直延續(xù)到復(fù)蘇后的再灌注期間，其發(fā)病機(jī)制包括循環(huán)因素（腦血流量失調(diào)）、生化代謝因素（ATP減少、無(wú)氧代謝增加、興奮性氨基酸增加、細(xì)胞內(nèi)鈣離子聚集、氧自由基及炎癥因子的產(chǎn)生），這些發(fā)病機(jī)制是研發(fā)腦損傷后神經(jīng)保護(hù)療法的基礎(chǔ)。 近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)環(huán)磷腺苷（Cyclic Adenosine-3'5'-monophosphata，cAMP）參與了多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制，在神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)

3、中也占有重要的地位。 cAMP是核苷酸衍生物，是細(xì)胞內(nèi)傳遞激素和遞質(zhì)的中介因子，因此也被稱為“第二信使”。細(xì)胞內(nèi)cAMP由ATP經(jīng)腺苷酸環(huán)化酶（AC）催化而成，由磷酸二酯酶（PDE）降解，cAMP維持穩(wěn)定是由二者的功能狀態(tài)決定的。細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的改變影響多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而調(diào)控蛋白活性、基因表達(dá)及細(xì)胞功能，對(duì)細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)、代謝及調(diào)亡過程發(fā)生影響。研究表明cAMP在神經(jīng)系統(tǒng)損傷中起重要的調(diào)控作用：①影響神經(jīng)細(xì)胞膜

4、蛋白的結(jié)構(gòu)和功能；參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸傳遞；②調(diào)節(jié)腦血管的舒縮功能；③阻止鈣離子內(nèi)流；④抑制病理狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)各種損害性細(xì)胞因子的表達(dá)和產(chǎn)生，如腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素、淀粉樣物質(zhì)等；⑤抗凋亡及促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)；⑥參與學(xué)習(xí)、記憶的過程。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明缺血再灌注損傷后大腦皮層及海馬組織cAMP和AC mRNA水平下降；脊髓損傷后受損局部及相應(yīng)大腦皮層cAMP水平也下降。臨床研究發(fā)現(xiàn)新生兒窒息后腦脊液中cAMP含量下降，且腦脊液中c

5、AMP的水平與病情的嚴(yán)重程度及預(yù)后密切相關(guān)。cAMP可能是調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的關(guān)鍵性因子之一，cAMP水平下降必將引起神經(jīng)系統(tǒng)某些功能紊亂，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。由此可以設(shè)想，缺血缺氧損傷后及時(shí)補(bǔ)充外源性cAMP，或給予延緩cAMP降解的藥物，提高cAMP水平至安全邊界，可能會(huì)在早期阻止cAMP信號(hào)途徑失調(diào)導(dǎo)致的瀑布效應(yīng)，最大限度地減輕缺血缺氧造成的損傷，促進(jìn)損傷神經(jīng)元功能的恢復(fù)。 研究表明脊髓損傷后給予外源性db-cAMP和P

6、DEⅣ抑制劑rolipram，提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平后，可促進(jìn)軸突再生、髓鞘的形成及神經(jīng)功能的恢復(fù)；另外還有研究表明腦缺血后給予rolipram可增強(qiáng)缺血后海馬神經(jīng)元的再生，促進(jìn)新生神經(jīng)元的存活。 環(huán)磷腺苷葡胺（MCA）是cAMP的新型衍生物，其以葡甲胺為配基增加了cAMP的脂溶性，使其更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，同時(shí)葡甲胺對(duì)磷酸二酯酶也具有抑制作用，更有利于cAMP生理功能的發(fā)揮。MCA在臨床上已廣泛用于治療心功能不全，對(duì)新生兒

7、窒息后心肌損傷也有一定的治療作用。有人觀察到MCA對(duì)成年大鼠腦缺血再灌注損傷的影響，結(jié)果顯示MCA預(yù)處理可減少梗死時(shí)神經(jīng)細(xì)胞的損傷，改善預(yù)后。但MCA對(duì)新生兒或新生動(dòng)物缺血缺氧后腦損傷是否具有保護(hù)作用國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。 氨茶堿是茶堿和乙二胺的復(fù)鹽，為非選擇性PDE抑制劑，通過抑制PDE，延緩細(xì)胞內(nèi)cAMP的降解，提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平。氨茶堿廣泛應(yīng)用于臨床，其藥理作用是多方面的：主要包括擴(kuò)張支氣管、強(qiáng)心、利尿、抗炎、治療早產(chǎn)兒反

8、復(fù)呼吸暫停、調(diào)節(jié)腦血流動(dòng)力學(xué)等方面。研究表明茶堿及氨茶堿可改善中風(fēng)后神經(jīng)損傷；減輕缺血后腦水腫及腦損傷；也有研究顯示茶堿對(duì)新生鼠缺血缺氧后腦損傷具有保護(hù)作用。 從理論上來(lái)講，MCA與氨茶堿聯(lián)合應(yīng)用在提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，調(diào)節(jié)腦血管舒縮功能，抗炎作用，改善心功能等方面可能具有協(xié)同作用。 目的：本研究采用新生大鼠缺血缺氧性腦損傷（HIBD）模型，試圖了解HIBD后腦組織內(nèi)cAMP水平的變化及其與腦損傷的關(guān)系，初步探討外源性

9、給予cAMP類藥物（MCA）、氨茶堿及兩藥聯(lián)合應(yīng)用對(duì)新生鼠HIBD的神經(jīng)保護(hù)作用，旨在為新生兒HIE的臨床治療提供新的思路與藥物。 方法： 1.新生鼠HIBD模型制作及模型成功的標(biāo)準(zhǔn) 參照Rice法制作新生鼠HIBD模型，新生SD大鼠經(jīng)無(wú)水乙醚麻醉后常規(guī)消毒，頸部正中切口，游離左側(cè)頸總動(dòng)脈，4號(hào)絲線永久結(jié)扎做缺血處理，縫合皮膚，生理鹽水擦干表面的血漬。術(shù)后恢復(fù)1-2h后，將動(dòng)物置于37℃常壓缺氧艙內(nèi)，以2-3L/

10、min的速度通入92%N2-8%O2混合氣體，2h后取出，制成HIBD模型，缺氧后返回母鼠身邊繼續(xù)喂養(yǎng)。缺血缺氧后參照Z(yǔ)eal Longa5分法進(jìn)行評(píng)分。0分：無(wú)神經(jīng)功能缺損的癥狀；1分：輕度局灶性神經(jīng)功能缺損，即提尾懸空不能伸展左側(cè)前爪；2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺損，即行走向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：重度局灶性神經(jīng)功能缺損，即行走困難，向左側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)水平下降。評(píng)分1-4分為造模成功。假手術(shù)組只切開頸部皮膚，游離左側(cè)頸總動(dòng)脈

11、，不結(jié)扎，縫合皮膚后不入缺氧艙，常規(guī)喂養(yǎng)。未出神經(jīng)功能缺損癥狀或死亡的動(dòng)物被剔除，隨機(jī)補(bǔ)充剔除的標(biāo)本，保證每組的實(shí)驗(yàn)例數(shù)為6例。 2.實(shí)驗(yàn)分組 2.1.缺血缺氧后腦組織內(nèi)cAMP含量的變化 36只7日齡SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血缺氧后2h組、24h組、48h組、72h組、168h（7天）組，每組6只；各組均于缺血缺氧后腹腔注射生理鹽水4ml/Kg，2次/日。 2.2.MCA和氨茶堿對(duì)新生大鼠HIBD

12、的干預(yù)作用 180只7日齡SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、HIBD組、MCA組、氨茶堿組、MCA+氨茶堿組（合用組）；每組36只：造模成功后，MCA組、氨茶堿組及合用組以腹腔注射法分別予MCA2mg/Kg、氨茶堿2mg/Kg、MCA2mg/Kg+氨茶堿2mg/Kg，2次/日，連用3天；HIBD組只注射等量的生理鹽水。 3.主要觀察指標(biāo) 3.1.缺血缺氧后腦組織內(nèi)cAMP水平的變化 各組分別在缺血缺氧后0h（假

13、手術(shù)組）、2h、24h、48h、72h、168h斷頭取左腦，制成10%的腦組織勻漿，用雙抗體夾心ABC-ELISA法測(cè)定各組腦組織內(nèi)cAMP含量。 3.2.藥物干預(yù)后腦組織內(nèi)cAMP水平的變化：各組分別予缺血缺氧后24h、48h、72h斷頭取左腦，制成10%的腦組織勻漿，用雙抗體夾心ABC-ELISA法測(cè)定各組腦組織內(nèi)cAMP含量。 3.3.藥物對(duì)缺血缺氧后腦組織含水量及腦損傷程度的影響缺血缺氧后72h，斷頭取腦，電子天

14、平分別稱出左右側(cè)大腦濕重，然后將左腦置于80℃恒溫干燥箱中48h后取出，稱干重。根據(jù)以下公式計(jì)算腦組織含水量及腦損傷程度：腦組織含水量=（損傷側(cè)濕重-損傷側(cè)干重）/損傷側(cè)濕重×100%；腦損傷=（未損傷側(cè)濕重-損傷側(cè)濕重）/未損傷側(cè)濕重×100%（缺血缺氧損傷后由于腦組織大面積的壞死，液化和萎縮，使損傷側(cè)大腦的重量明顯輕于未損傷側(cè)，以此反應(yīng)腦損傷的程度）。 3.4.藥物對(duì)缺血缺氧后腦組織氧化代謝產(chǎn)物丙二醛（MDA）、超氧化物歧化

15、酶（SOD）含量的影響：缺血缺氧后72h，斷頭取左腦，制成10%的腦組織勻漿，SOD采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定；MDA應(yīng)用改良的硫代巴比妥酸法測(cè)定。 3.5.藥物對(duì)缺血缺氧后腦組織病理改變的影響新生鼠深度麻醉，行心臟灌注后，斷頭取全腦，以4%多聚甲醛液固定24h，取材后行脫水，石蠟包埋，冠狀切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，分別在200倍、400倍鏡下觀察大腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)變化。 3.6.藥物對(duì)缺血缺氧后神經(jīng)功能缺失評(píng)分的

16、影響各組新生鼠于缺血缺氧后2h，24h，72h參照Z(yǔ)eal Longa5分法行運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分。 結(jié)論： 1.實(shí)驗(yàn)證實(shí)缺血缺氧后腦組織內(nèi)cAMP代謝紊亂，缺氧后2小時(shí)腦組織內(nèi)cAMP水平明顯下降（至正常的25%左右），隨著時(shí)間的延長(zhǎng)可逐漸升高，但7天后仍低于正常水平（達(dá)70%左右），說明缺血缺氧后機(jī)體有一定的自我修復(fù)能力，但能力有限且修復(fù)時(shí)間較長(zhǎng)，這為cAMP類藥物的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 2.研究顯示MCA干預(yù)后

17、可顯著提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平、減輕腦水腫，減少氧自由基的生成，有效改善臨床運(yùn)動(dòng)功能；提示cAMP代謝紊亂可能參與腦缺血缺氧損傷的病理機(jī)制，及早給予外源性cAMP類藥物對(duì)缺血缺氧性腦損傷具有一定的保護(hù)和修復(fù)作用。 3.研究發(fā)現(xiàn)氨茶堿可協(xié)助cAMP類藥物提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平；氨茶堿單獨(dú)應(yīng)用同樣具有減輕腦組織損傷作用，提示氨茶堿可能通過多重藥理作用發(fā)揮了腦保護(hù)作用。 4.兩藥聯(lián)合應(yīng)用，除腦含水量指標(biāo)外，其它指標(biāo)均優(yōu)于單用藥組