DENV-2作用HUVEC后對(duì)細(xì)胞凋亡、周期以及基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的：研究登革2型病毒（Dengue Virus type2）DENV-2作用原代臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）后，病毒感染率、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡情況，并利用基因芯片檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞被病毒作用前后表達(dá)差異明顯的基因，為研究DENV-2直接作用血管內(nèi)皮細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞的影響提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：利用C6/36細(xì)胞擴(kuò)增DENV-2，RT-PCR實(shí)驗(yàn)和測(cè)序鑒

2、定病毒；病毒蝕斑實(shí)驗(yàn)滴定 DENV-2，設(shè)定病毒感染劑量均為 MOI=10用于下游實(shí)驗(yàn)；對(duì)分離培養(yǎng)的原代HUVEC做胞內(nèi)Ⅷ因子檢測(cè)以及細(xì)胞表面CD31分子的表達(dá)檢測(cè)，鑒定HUVEC純度；用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)DENV-2作用原代HUVEC不同時(shí)間點(diǎn)（12、24h、48h、72h），其胞內(nèi)DENV-2 NS1基因、E基因mRNA水平表達(dá)的變化；同時(shí)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞周期，細(xì)胞凋亡情況以及病毒感染率情況，ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)

3、上清NS1蛋白表達(dá)情況，再通過基因芯片的方法檢測(cè)DENV-2作用后原代HUVEC發(fā)生改變的基因。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞貼壁呈梭型，生長(zhǎng)良好，輪廓清晰，符合HUVEC生長(zhǎng)特點(diǎn)；免疫組化法檢測(cè)HUVECⅧ因子的高表達(dá),利用流式細(xì)胞儀可檢測(cè)到HUVEC表面CD31分子表達(dá)高達(dá)98.56％，證實(shí)此為HUVEC。
　　2.擴(kuò)增后的病毒測(cè)序結(jié)果與GENE BANK比對(duì)
　　3.病毒噬斑結(jié)果為1.4×108PFU/ml

4、r>　　4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)DENV-2作用HUVEC后，不同時(shí)間點(diǎn)胞內(nèi)DENV-2 NS1、E基因 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兩者均在24h到達(dá)高峰，48h和72h依次降低。與12h相比，E基因的表達(dá)倍數(shù)依次為65.30、29.40、8.69（24、48、72h）；而 NS1基5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)DENV-2作用原代HUVEC凋亡，發(fā)現(xiàn)各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡無(wú)明顯差異，P＞0.05；細(xì)胞周期G1期、S期以及G2期，各組比較下來(lái)，P＞0.05

5、，無(wú)明顯差異。以BHK細(xì)胞做陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)病毒在原代HUVEC的感染率，即使在感染72h后，病毒的感染率也低于15%
　　6.與滅活病毒組相比，DENV-2作用原代 HUVEC不同時(shí)間點(diǎn)，感染組上清 NS1各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯差異，P＞0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　7.基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DENV作用HUVEC后，可引起IL-6、C3、SOS、CXCL9、IFN-β等基因明顯上調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.即使在