DENV-2對原代HHSECs凋亡,自噬及其相關基因表達的影響.pdf

1、目的：研究Ⅱ型登革病毒（DENV-2）感染原代人肝竇內(nèi)皮細胞（HHSEC）后，HHSECs的凋亡、自噬情況，以及ICAM-1和Beclin-1 mRNA水平的，并分析它們在登革病毒致病過程中可能的機制。
　　方法：通過流式細胞術檢測細胞膜表面CD31分子；免疫組化法檢測細胞漿Ⅷ因子的表達，以鑒定HHSECs。RT-PCR擴增DENV-2 NS1基因部分序列，鑒定病毒；根據(jù)NS1的序列設計酶切位點，HindⅢ酶切，預期酶切片段大小為

2、228bp和185bp，對病毒進一步鑒定；測定DENV-2對C6/36細胞的TCID50。以105TCID50的DENV-2作用于HHSECs，實時熒光定量PCR動態(tài)檢測DENV-2 NS1部分序列，以觀察HHSECs受DENV-2感染的情況；CCK8法動態(tài)觀察受感染細胞的損傷情況并計算其抑制率。實時熒光定量PCR動態(tài)檢測被DENV-2感染的HHSECs的ICAM-1及Beclin-1（自噬相關基因）mRNA水平的表達。流式細胞術檢測被

3、DENV-2感染后的HHSECs細胞凋亡率，LC3B（自噬相關蛋白）以及ICAM-1的表達。
　　結果：細胞呈梭形，生長良好，輪廓清晰，“鵝卵石”樣排列；免疫組化法檢測HHSECsⅧ因子的表達，DAB染色后與空白對照對比，可見細胞漿含棕黃色的顆粒；流式細胞儀檢測CD31表達率87.1％，符合HHSECs的特點。RT-PCR擴增DENV-2 NS1基因部分序列，擴增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，長度在400bp左右，與預期長度413b

4、p一致，證實為DENV-2 NS1部分基因序列；HindⅢ酶切得到兩條酶切片段，長度在200bp左右，和預期一致；DENV-2毒株對C6/36細胞的TCID50為10-6.845/ml。Real time PCR檢測HHSECs中NS1基因mRNA的表達：未感染組不表達NS1基因；DENV-2作用于HHSECs后，表達DEN V-2 NS1 mRNA，DENV-2可感染HHSECs并在其中增殖，且于36h達峰值，以12h為對照，計算2-

5、△△Ct值為11.33±1.77（P<0.05）。病毒作用細胞后，CCK8法檢測DENV-2對細胞的毒性作用，細胞與未感染組有差別，不同時間點抑制率分別為10.9%±1.24%（12h），16.4%±0.42%（24h），17.0%±0.46%（36h），29.6%±0.26（48h）。流式細胞術動態(tài)觀察被DENV-2感染的HHSEC凋亡情況，12h的凋亡率為13.17%，最為明顯；之后逐漸減少，24h、36h和48h分別為4.31%，

6、3.909%和2.975%。流式細胞術動態(tài)檢測被DENV-2感染的HHSECs，其LC3B的表達于36h達到峰值，表達率為35.5%；12h，24h和48h LC3B的表達率，分別為17.0%，22.3%和20.8%。流式細胞術動態(tài)檢測被 DENV-2感染的HHSECs表面ICAM-1表達，12h，24h，36h和48h分別為9.17%，14.7%，12.7%，11.6%。Real time PCR檢測HHSECs中相關基因mRNA的表

7、達水平：Beclin1及 ICAM-1 mRNA在24h達峰值，以未感染組為對照，2-△△Ct值分別為46.77±2.55和40.97±4.91，爾后逐漸下降。
　　結論：HHSEC對DENV-2易感；且DENV-2對HHSECs生長有抑制作用；并可誘導ICAM-1上調(diào)，激活HHSECs。這或許可以成為探究登革病毒致病機制的新模型。HHSEC被DENV-2感染后，LC3B及Beclin1的表達增高；DENV-2感染早期可誘導HHS