煙曲霉感染對HUVEC表達TF、vWF及細胞凋亡的影響.pdf

1、第一部分煙曲霉菌絲感染后HUVEC表達TF及vWF的變化
　　 目的：通過建立煙曲霉菌絲感染人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical veinendothelial cell HUVEC)的體外模型，①觀察煙曲霉菌絲感染后HUVEC表達組織因子(tissue factor TF)和血管假性血友病因子(von Willebrand Factor vWF)的水平；②分別用細胞松弛素D、N-鈣粘蛋白單克隆抗體或地塞米松處理HU

2、VEC，觀察煙曲霉菌絲感染后HUVEC表達TF和vWF的變化，以探討侵襲性曲霉病血管侵襲的機制。
　　 方法：接種于24孔板的HUVEC長滿融合后，加入預先配置的濃度為1×105CFU/ml煙曲霉菌絲懸液，建立煙曲霉菌絲感染血管內(nèi)皮細胞模型。實驗分為六組，每組總反應體積200μl，即①空白對照組：細胞不予任何刺激；②TNF-α組：細胞予TNF-α(濃度100 ng/ml)刺激；③煙曲霉菌絲組：煙曲霉菌絲懸液濃度為105 CFU/

3、ml；④細胞松弛素D組：HUVEC長滿融合后，實驗前10 min用細胞松弛素D溶液處理，加入配制好的煙曲霉菌絲懸液(細胞松弛素D終濃度為70 nmol/L，煙曲霉菌絲懸液濃度為105 CFU/ml)；⑤N-鈣粘蛋白抗體組：HUVEC細胞長滿融合，予濃度1∶100的小鼠抗人N-鈣粘蛋白單克隆抗體處理1 h后，加入配制好的煙曲霉菌絲懸液(煙曲霉菌絲懸液濃度為105CFU/ml)；⑥地塞米松組：地塞米松和煙曲霉菌絲同時加入(地塞米松濃度為10

4、-4mol/L，煙曲霉菌絲懸液濃度為105CFU/ml)。加入煙曲霉菌絲后，分別于共培養(yǎng)0、2、6、12、18 h終止實驗以獲取細胞凍融液和2、6、12、18 h提取細胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA法分別檢測TF、vWF濃度。
　　 結(jié)果：
　　 一、TF變化：除空白對照組外，各實驗組HUVEC的TF表達量在2、6、12、18 h與0 h比較均升高(P＜0.05)，而空白對照組則無明顯變化；各組間0 h的TF表達量差異無統(tǒng)

5、計學意義；各實驗組HUVEC的TF表達量在2、6、12、18 h高于空白對照組(P＜0.05)；TNF-α組HUVEC的TF表達量在2、6、12 h分別為503.64±53.26ng/L、1272.60±186.38 ng/L、908.97±133.11 ng/L，明顯高于煙曲霉菌絲組相應時間點的387.33±57.05 ng/L、523.56±74.26 ng/L、659.76±91.40 ng/L(P＜0.01)；細胞松弛素D組與煙

6、曲霉菌絲組比較，TF表達量在各時間點差異均無統(tǒng)計學意義；N-鈣粘蛋白抗體組的TF表達量在2、6、12 h分別為300.12±47.31ng/L、378.61±72.27ng/L、509.86±67.57ng/L，低于煙曲霉菌絲組相應時間點的387.33±57.05 ng/L、523.56±74.26ng/L、659.76±91.40 ng/L(P＜0.05)；地塞米松組與煙曲霉菌絲組比較，HUVEC的TF表達量在各時間點差異均無統(tǒng)計學意

7、義。
　　 二、vWF變化：與2 h比較，空白對照組和TNF-α組的vWF表達量在18 h增加(P＜0.05)，其余各組vWF表達量在6、12、18 h均增加(P＜0.05)；各實驗組與空白對照組比較，除N-鈣粘蛋白抗體組HUVEC的vWF表達量在2 h無明顯變化外，其余各時間點vWF表達量在2、6、12、18 h均升高(P＜0.05)；TNF-α組HUVEC的vWF表達量在2 h為64.45±7.58ng/mL，高于煙曲霉菌絲

8、組51.49±6.41 ng/mL(P＜0.05)，而在18 h為91.05±18.90 ng/mL，低于煙曲霉菌絲組133.73±19.49 ng/mL(P＜0.05)；細胞松弛素D組HUVEC的vWF表達量與煙曲霉菌絲組比較在各時間點差異均無統(tǒng)計學意義；N-鈣粘蛋白抗體組HUVEC的vWF表達量在2 h、6 h分別為38.95±6.26 ng/mL和61.99±5.41 ng/mL，低于煙曲霉菌絲組相應時間點的51.49±6.41n

9、g/mL和78.66±10.43 ng/mL(P＜0.05)；地塞米松組與煙曲霉菌絲組vWF表達量在各時間點差異均無統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論：本實驗結(jié)果提示：①建立煙曲霉菌絲感染HUVEC的體外模型是可行的；②煙曲霉菌絲感染造成HUVEC損傷，過度表達TF和vWF；③細胞松弛素D對煙曲霉菌絲感染后HUVEC表達TF及vWF無明顯影響；④N-鈣粘蛋白單克隆抗體可抑制煙曲霉菌絲感染后HUVEC表達TF及vWF；⑤地塞米松對煙曲霉菌絲

10、感染的HUVEC表達TF及vWF無明顯影響。
　　 第二部分煙曲霉菌絲誘導HUVEC凋亡
　　 目的：應用煙曲霉菌絲感染HUVEC體外模型，觀察煙曲霉菌絲感染后HUVEC的凋亡情況。
　　 方法：建立煙曲霉菌絲感染HUVEC的體外模型(具體同第一部分)。實驗分三組：①空白對照組，細胞不予任何刺激；②煙曲霉菌絲組Ⅰ(濃度105CFU/ml)③煙曲霉菌絲組Ⅱ(濃度106CFU/ml)。用流式細胞儀于2、4、8 h三個

11、時相點檢測HUVEC凋亡率。
　　 結(jié)果：除空白對照組外，暴露于煙曲霉菌絲組Ⅰ和Ⅱ的HUVEC凋亡率在2、4、8 h逐漸增加(P＜0.05)；煙曲霉菌絲組Ⅰ2、4、8 h的HUVEC凋亡率分別為9.76±1.47％、13.47±1.83％、20.08±2.36％，明顯高于空白對照組相應時間點的1.61±0.17％、1.72±0.16％、1.84±0.18％(P＜0.01)；煙曲霉菌絲組Ⅱ2、4、8 h的HUVEC凋亡率分別為12