RNA干擾沉默HOXA5基因表達及對Jurkat細胞周期和凋亡的影響.pdf

1、目的：為探索白血病發(fā)生發(fā)展、增殖及凋亡與HOXA5基因的關(guān)系，本文首先觀察兒童急性淋巴細胞白血?。ˋcute lymphoblastic leukemia, ALL）患兒骨髓(homeobox,HOX)A5的表達情況。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計合成針對HOXA5基因表達的小干擾RNA(small interference,siRNA)序列，并測定其 siRNA的功能,從而構(gòu)建針對 HOXA5shRNA真核表達載體pRNAT-GFP-Neo-HOX

2、A5,轉(zhuǎn)染人急性T淋巴細胞白血病細胞株（Jurkat），觀察其對Jurkat細胞周期及凋亡的影響，為進一步探討白血病的發(fā)生機制及靶向治療提供理論依據(jù)。方法：1.病例及分組：ALL急性期：ALL初發(fā)25例；ALL緩解期：25例ALL經(jīng)誘導(dǎo)緩解治療達完全緩解（ALL-CR）組；對照組：免疫性血小板減少癥（Immune thrombocytopenia, ITP）患兒，共20例。在征得患兒家屬同意的前提下對樣本進行采集。采用淋巴細胞分離液分離

3、骨髓單個核細胞。2.實時熒光定量 PCR（FQ-PCR）和蛋白質(zhì)印記法（Western blot）測定ALL急性期、ALL緩解期及對照組（ITP）三組骨髓單個核細胞HOXA5mRNA和蛋白相對表達量。3.根據(jù)HOXA5基因的mRNA序列，設(shè)計合成三條針對HOXA5基因不同位點的siRNA序列，并篩選有效干擾HOXA5基因表達的特異性siRNA序列,構(gòu)建靶向HOXA5的shRNA真核表達載體pRNAT-GFP-Neo-siHOXA5。4.

4、實驗分組：取對數(shù)期細胞（約3x107/ml），將Jurkat細胞分為三組：實驗組(脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染靶向 HOXA5的 siRNA)、陰性對照組(脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA)和空白對照組(僅加等量細胞及培養(yǎng)基)。5.轉(zhuǎn)染后 FQ-PCR:通過脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000介導(dǎo) siRNA轉(zhuǎn)染 Jurkat細胞,48h后通過FQ-PCR和Western blot測定實驗組、陰性對照組和空白對照組三組Jurkat細胞HOXA5mR

5、NA和蛋白相對表達水平。6.流式細胞分析儀檢測：測定特異性siRNA抑制HOXA5基因表達后，實驗組、陰性對照組和空白對照組三組 Jurkat細胞周期分布和凋亡率的變化。結(jié)果：1 HOXA5mRNA表達量ALL急性期(0.76±0.05)％顯著高于ALL緩解期(0.48±0.07)%和對照組(0.47±0.08)%（P<0.05）。ALL急性期（0.70±0.02）HOXA5蛋白表達量顯著高于ALL緩解期（0.39±0.03）和（ITP

6、）對照組（0.42±0.02）（P<0.05）。2設(shè)計并構(gòu)建針對HOXA5基因的段發(fā)卡RNA(Short hairpin,shRNA)，與陰性對照組和空白對照組相比，實驗組HOXA5基因的表達量明顯下降，轉(zhuǎn)染后實驗組各組 Jurkat細胞基因表達受抑制，通過FQ-PCR和 Western blot檢測出基因沉默效果最好的1條質(zhì)粒，其中序列pRNAT-GFP-Neo-HOXA5C的效果最為顯著。3成功構(gòu)建了有效沉默H O X A5基因的質(zhì)

7、粒表達載體；與陰性對照組(0.73±0.003)及空白對照組(0.73±0.01)相比，實驗組（ pRNAT-GFP-Neo-HOXA5C）H O X A5 m R N A表達水平(0.17±0.01)較明顯下降（ P<0.05）。與陰性對照組(1.34±0.06)％和空白對照組(1.29±0.21)%相比，實驗組（pRNAT-GFP-Neo-HOXA5C）Jurkat細胞 HOXA5蛋白表達水平(0.39±0.01)%明顯下降（P<0

8、.05）。4pRNAT-GFP-Neo-siHOXA5C重組載體轉(zhuǎn)染Jurkat細胞，與陰性對照組和空白對照組相比，實驗組Jurkat細胞G0/Gl期細胞比例明顯增加(38.69％±2.2％和38.55％±6.0％VS56.70％±6.4％)，S期細胞比例相應(yīng)下降(48.86%±6.0%和49.53%±8.3%VS29.00%±5.5%)（P<0.05）。實驗組細胞凋亡率為(24.99±5.16)％，顯著高于陰性對照組(13.94±O.