抗病毒治療中HBV基因型轉換機制及臨床意義研究.pdf

1、乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）感染是公認的全球性疾病，對其感染的控制和清除，仍然是21世紀公共健康問題的一大挑戰(zhàn)。目前，對于丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus，HCV）感染的基因型判定已成為治療的重要提示，而HBV基因型是否會影響抗病毒治療效果，HBV基因型與藥物反應性的關系如何，仍然撲朔迷離。近些年，隨著核苷類似物大量長期使用，在HBV抗病毒治療過程中發(fā)生不同基因型轉換的現(xiàn)象時有報道，但其發(fā)生的機制與

2、潛在的臨床意義，卻未能引起足夠的重視。我們前期研究提示，由于HBV基因型混合感染可能是普遍現(xiàn)象，并以一種基因型占絕對優(yōu)勢的形式存在，當選擇壓力出現(xiàn)時，不同基因型對選擇壓力存在敏感性的差異，最終導致基因型轉換的發(fā)生。因此，我們就需要建立高靈敏度的基因分型檢測方法，以闡明基因型轉換這一臨床現(xiàn)象發(fā)生的機制及其臨床意義，研究結果將對臨床個體化治療具有潛質應用前景。
　　目的：通過建立高靈敏度基因分型檢測方法，闡明抗病毒治療中HBV基因型轉

3、換的機制，結合病毒學、免疫學、生化學檢測指標，探討基因型轉換與抗病毒藥物療效之間的關系及臨床意義。
　　方法：本研究中，我們將小溝結合探針（MGB）和肽核酸（PNA）封閉探針聯(lián)用的新策略應用于熒光定量PCR檢測平臺，建立了一種高靈敏的HBV基因型型特異熒光定量PCR檢測法；同時，還構建了基于深度測序技術的大樣本平行測序HBV基因型檢測法，這兩種方法均能大幅度提高不同基因型混合感染的檢出率，高靈敏度的定性定量基因分型數(shù)據(jù)為闡明基因型

4、轉換的本質提供了堅實的實驗基礎。隨后，我們對38例阿德福韋（AdefovirdDipivoxil,ADV）治療一年患者的基因型與HBV病毒載量、HBeAg水平及肝功能水平等進行了縱向研究，從基因型混合感染是前提，選擇壓力是必要條件，不同基因型對藥物敏感性的差異是關鍵三個層面，闡明了抗病毒治療中HBV基因型轉換的本質，并結合臨床檢測數(shù)據(jù)，探討了基因型轉換的臨床意義。
　　結果：Sanger測序結果顯示，38例病人中有13例發(fā)生基因型

5、轉換，且主要是C型到B型的轉換。而深度測序結果顯示，所有發(fā)生基因型轉換的標本在ADV治療前已經(jīng)是B和C型混合感染。進一步用深度測序對200例臨床標本檢測其混合感染的情況，結果混合感染比例高達95.5％（191/200）,其中僅12%的標本混合感染比例>1%。深度測序結果提示中國人群中HBVB型和C型的混合感染是一種普遍現(xiàn)象。選擇壓力與基因型轉換關聯(lián)分析的結果顯示，藥物反應性好和HBeAg轉陰的患者更容易發(fā)生基因型轉換，并且對兩種選擇壓力

6、均敏感的患者，基因型轉換率要遠遠高于對兩者均不敏感的患者（50%vs20%），驗證了選擇壓力對于基因型轉換的必要性。38例患者ADV治療前后基因型B和C的變化總量的統(tǒng)計結果顯示，C型總量下降，B型上升，兩組間具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），并且在38例患者中，治療前為C型的患者發(fā)生基因型轉換的頻率高于B型患者（P＜0.01），統(tǒng)計結果均支持C型對ADV更敏感，表明不同基因型對藥物敏感性的差異是基因型發(fā)生轉換的關鍵因素。最后，通過對38例

7、ADV治療乙肝患者的臨床資料分析表明，發(fā)生基因型轉換組較未轉換組，肝功能復常（ALT）的比例更高（P＜0.05），血清學轉換率（HBeAg）也更高（P＜0.01），HBVDNAload下降程度更大，總體治療效果更好，這也說明HBV基因型轉換研究具有重要的臨床意義。
　　總結：本研究建立了兩種高靈敏度的HBV基因分型檢測方法，對于混合感染中劣勢基因型的檢測具有很高的靈敏度和準確性，大大提高混合感染的檢出率，并均具備臨床大樣本的檢測能

8、力，適用于抗病毒治療過程中HBV基因型的動態(tài)監(jiān)控。并圍繞基因型轉換這一臨床現(xiàn)象，以ADV抗病毒治療臨床研究隊列為回顧性研究對象，采用已建立的高靈敏度基因分型方法作為定性定量分析工具，從混合感染是基因型轉換的前提，選擇壓力是基因型轉換的必要條件，不同基因型對藥物敏感性存在差異是基因型轉換的關鍵因素這三個層面闡明了抗病毒治療中HBV基因型發(fā)生轉換的本質，并結合臨床檢測指標，探討基因型轉換與抗病毒藥物療效間的關系。本研究豐富了我們對HBV不同