βB2晶體蛋白基因敲除可引起白內(nèi)障并降低C57BL-C小鼠生殖功能.pdf

1、晶狀體中的蛋白質(zhì)主要包括晶體蛋白(crystallins)、膜蛋白(membraneprotein)和細胞骨架蛋白(cytosteletal protein)等。按水溶性與否可分為可溶性蛋白(晶體蛋白)、非可溶性蛋白(膜蛋白、細胞骨架蛋白、聚合的晶體蛋白)。人晶狀體內(nèi)90％的可溶性蛋白是晶體蛋白：分別是α、β和γ晶體蛋白。 目前對α-晶體蛋白的功能研究比較廣泛，它的分子伴侶作用已得到世界公認。對β-晶體蛋白的研究還比較少，其中β

2、B2晶體蛋白(βB2 crystallin，Crybb2)在β族晶體蛋白中含量最高，而且它的水溶性成分呈年齡依賴性增高，因此，它的正常結(jié)構(gòu)及其水溶性成分水平，對維持晶狀體的高折射系數(shù)和透明至關(guān)重要。這種反常性增高勢必包含了它在維持晶狀體透光性中的重要作用，因此它的功能值得進一步研究。 基因敲除是研究蛋白功能的一個重要手段，已有研究證明α-晶體蛋白基因敲除可以導(dǎo)致白內(nèi)障，而且α或β-晶體蛋白基因突變也可以導(dǎo)致白內(nèi)障。文獻報道Cry

3、bb2基因突變可降低生殖功能。目前國內(nèi)外尚未有Crybb2基因敲除動物模型的報道，因此我們選擇此蛋白作為靶點，利用Crybb2基因敲除小鼠模型，來研究該蛋白在維持晶狀體透明性中的作用和其晶狀體外生物學(xué)功能。 本文主要通過觀察Crybb2基因敲除對小鼠晶狀體結(jié)構(gòu)的影響及其在晶狀體內(nèi)和晶狀體外組織的定位，分析該蛋白在維持晶狀體透明性中的作用并研究其晶狀體外功能。主要方法： 1．Crybb2基因敲除小鼠模型的建立及鑒定

4、 此部分工作是應(yīng)第二軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實驗室要求，與美國紐約iGTL實驗室合作并最終在美國iGTL實驗室完成，最后以饋贈方式供我們研究專用。小鼠品系為C57BL/C小鼠，小鼠模型為10只雜合子，已成功進行繁殖超過30代，子代小鼠生長發(fā)育狀況良好。 取鼠尾末端組織，通過PCR技術(shù)對小鼠基因型進行鑒定：取小鼠眼晶狀體進行勻漿離心后取上清液，通過Western blot技術(shù)對晶體蛋白的表達進行鑒定。鑒定后將小鼠分類飼養(yǎng)繁殖。

5、 2．Crybb2基因敲除小鼠晶狀體結(jié)構(gòu)特征 用暗視野顯微鏡觀察經(jīng)氧化損傷后晶狀體體外培養(yǎng)的混濁程度。HE染色觀察晶狀體囊膜下皮質(zhì)的厚度隨年齡的變化，并與野生型同品系小鼠對比。免疫組織化學(xué)研究其在晶狀體內(nèi)的定位。 3．Crybb2基因敲除小鼠晶狀體外功能研究 圖形視網(wǎng)膜電圖(pattern electroretinogram，P-ERG)研究Crybb2基因敲除后視覺電生理的改變。Western Blot，P

6、CR和免疫組織化學(xué)方法檢測Crybb2 mRNA，Crybb2在晶狀體外陽性表達(視網(wǎng)膜、大腦、脊髓、睪丸、卵巢)，盡管是低水平表達。數(shù)小鼠產(chǎn)仔數(shù)，精子計數(shù)，睪丸稱重，大體形態(tài)和HE染色觀察形態(tài)學(xué)改變研究Crybb2基因敲除后小鼠生殖功能的改變，并與野生型同品系小鼠對比。 實驗結(jié)果： 1．Crybb2基因敲除小鼠模型建立后，經(jīng)Western blot鑒定，純合小鼠晶體蛋白未檢測到Crybb2的表達，雜合及野生型小鼠晶體蛋

7、白在分子量23KD處檢測到該蛋白的表達。 2．Crybb2基因敲除導(dǎo)致小鼠白內(nèi)障的發(fā)生，白內(nèi)障均發(fā)生在前或后皮質(zhì)部，最早發(fā)生于出生后8周左右。Crybb2定位于晶狀體皮質(zhì)囊膜下，基因敲除后，晶狀體抗氧化能力下降，隨年齡增加，皮質(zhì)變薄。 3．P-ERG檢查發(fā)現(xiàn)Crybb2基因敲除小鼠振幅降低。野生型小鼠視網(wǎng)膜，大腦，脊髓，睪丸，卵巢中可檢測到Crybb2 mRNA，Crybb2陽性表達。Crybb2基因敲除后，精子活力下降