先天性白內(nèi)障相關(guān)的βB2晶狀體蛋白突變的致病機(jī)制研究.pdf

1、βB2晶狀體蛋白是人眼晶狀體中重要的結(jié)構(gòu)蛋白，與維持晶狀體的透明性與屈光性密切相關(guān)，其潛在的生理功能尚不明確。目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)βB2晶狀體蛋白基因突變導(dǎo)致先天性白內(nèi)障的報(bào)道已有不少，但是針對(duì)突變具體的致病機(jī)制研究仍很缺乏。為了更好地闡明白內(nèi)障的發(fā)生機(jī)理，從現(xiàn)有的與βB2晶狀體蛋白相關(guān)的基因突變中，選取數(shù)個(gè)有意義的關(guān)鍵位點(diǎn)（位于蛋白N末端的突變A2V，以及四個(gè)與色氨酸相關(guān)的突變S31W、R145W、W59C、W151C），研究這些突變對(duì)βB

2、2晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、細(xì)胞內(nèi)分布等方面的影響。
　　通過(guò)PCR從人眼cDNA文庫(kù)中克隆βB2晶狀體蛋白的完整編碼序列，構(gòu)建野生型βB2晶狀體蛋白和包含各突變位點(diǎn)的質(zhì)粒，原核表達(dá)質(zhì)粒采用pET28a，真核表達(dá)質(zhì)粒采用pEGFP-C3和pcDNA3.1-flag;原核表達(dá)獲取目標(biāo)蛋白并純化，采用生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究手段，明確突變前后蛋白結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)方面的改變;并轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，使野生型和突變型蛋白分別在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，觀察蛋

3、白在細(xì)胞內(nèi)定位以及對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。
　　我們發(fā)現(xiàn)，A2V突變沒(méi)有改變?chǔ)翨2晶狀體蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，卻影響了蛋白的四級(jí)構(gòu)象，破壞了蛋白同源四聚體的形成;降低了蛋白的熱穩(wěn)定性，使蛋白在高溫下更容易聚集;不影響對(duì)抗化學(xué)變性劑和紫外輻射的穩(wěn)定性，卻使蛋白在復(fù)性過(guò)程更易發(fā)生聚集。W59C和W151C突變使βB2的疏水暴露增加，直接導(dǎo)致突變后蛋白的溶解度顯著降低;S31W和R145W這兩個(gè)突變則導(dǎo)致了蛋白熱穩(wěn)定性的明顯下降;另外我們證實(shí)了

4、色氨酸相關(guān)的突變影響了βB2晶狀體蛋白對(duì)于紫外輻照的穩(wěn)定性，除R145W外，其余三個(gè)突變體的穩(wěn)定性較野生型下降，R145W卻比野生型更能抵抗紫外能量的損傷;將四個(gè)突變體在HeLa細(xì)胞中過(guò)表達(dá)后，W59C和W151C在胞內(nèi)出現(xiàn)了明顯的聚集現(xiàn)象，這可能與它們的的溶解度有關(guān)，與蛋白水平的結(jié)果一致，說(shuō)明溶解度下降很可能是這兩個(gè)突變?cè)诔錾幢憩F(xiàn)為白內(nèi)障的原因。
　　以上結(jié)果表明，βB2晶狀體蛋白的N末端的突變會(huì)對(duì)自身的寡聚化造成影響，位于疏