C57BL-6J小鼠和健康成人肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)表達(dá)譜研究.pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為內(nèi)膜系統(tǒng)的核心，具有參與蛋白質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運(yùn)，糖原分解和脂類、膽固醇合成等功能。肝臟中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還參與內(nèi)源的疏水代謝產(chǎn)物和異源物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的失調(diào)能引起細(xì)胞的功能異常和一系列疾病。為了深入了解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在肝臟中所發(fā)揮的重要功能，我們對(duì)C57BL/6J小鼠和成人健康肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)組進(jìn)行了研究。 作為人類肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃(Human liverproteome project HLPP)一部分，本研究采用了聯(lián)合提取細(xì)

2、胞器的策略，可以同時(shí)從同一個(gè)肝臟勻漿液中獲得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、胞漿、線粒體、細(xì)胞膜和細(xì)胞核多種細(xì)胞器樣本。聯(lián)合提取細(xì)胞器，的技術(shù)策略一方面可以充分利用樣品，尤其是難以獲得的臨床樣本；另一方面可以有利于將來(lái)對(duì)來(lái)自同一勻漿液的各個(gè)亞細(xì)胞組分進(jìn)行系統(tǒng)比較。 樣品的準(zhǔn)備是組織來(lái)源的亞細(xì)胞組分分離的關(guān)鍵，本文首次對(duì)新鮮樣本、凍存液凍存樣本和直接凍存樣本提取的細(xì)胞器進(jìn)行了比較，提出了一種備選的除新鮮組織之外的樣品準(zhǔn)備方案，即凍存的肝勻漿液方式，該方

3、法尤其適合于不方便新鮮獲得的臨床樣本及滿足樣本建庫(kù)的需求。另外，我們通過(guò)綜合評(píng)價(jià)提出，直接凍存的肝臟組織所提取細(xì)胞器不適合用于表達(dá)譜研究。 在獲得了高度富集內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分的基礎(chǔ)上，我們分別構(gòu)建了C57BL/6J小鼠和成人健康肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)表達(dá)譜。由于肝臟樣本的復(fù)雜性和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自身組成的多樣性，我們有必要選擇一種適合分離復(fù)雜樣本的高通量蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)路線。SDS-PAGE結(jié)合nano-LC-ESI-MS/MS技術(shù)策略，是一種被廣泛

4、采用的通量化蛋白質(zhì)組技術(shù)路線。本研究在選用該技術(shù)策略基礎(chǔ)上，同時(shí)引入了質(zhì)譜分段掃描的分離模式(Gas phase fractionation，GPF)，該模式根據(jù)m/z比在肽段水平上對(duì)其進(jìn)行第三維的分離。結(jié)果表明，分段掃描的引入分別從肽段和蛋白質(zhì)水平上增加了50％的鑒定率，從而有效擴(kuò)展了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)組。另外對(duì)分段掃描所捕捉到的電荷性質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)980-1600波段能夠有效地捕捉到容易在全波段掃描丟失掉的單電荷肽段。 在高通

5、量的3-D蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)路線基礎(chǔ)上，采用反庫(kù)評(píng)價(jià)方法對(duì)蛋白質(zhì)可信度進(jìn)行評(píng)估，存大于95％置信度、雙肽段以上匹配的高可信度卡值的標(biāo)準(zhǔn)下，分別有1065、921種蛋白質(zhì)在小鼠肝臟滑面、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中得到鑒定； 1254和920種蛋白質(zhì)在成人肝臟滑面和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中得到鑒定。采用本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)Gene Ontology(http：//www．ebi．a(chǎn)c．uk/ego/)開(kāi)發(fā)的軟件GOfact工具對(duì)小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行功能注

6、釋，結(jié)果顯示除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)所特定的功能模塊得到了顯著富集外，我們很意外的發(fā)現(xiàn)滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相對(duì)富集了鈣結(jié)合蛋白質(zhì)。將我們的數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)組(大鼠分泌途徑蛋白質(zhì)組，1237個(gè)蛋白質(zhì))進(jìn)行比較，兩者共有662個(gè)蛋白質(zhì)，分別占自身和大鼠數(shù)據(jù)的53.5％和42.5％。推測(cè)這部分共有的蛋白質(zhì)可能是組成型表達(dá)蛋白質(zhì)，對(duì)維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的基本生理學(xué)功能發(fā)揮重要作用。Gene Ontology超幾何分析證明了這個(gè)推測(cè)。分別將兩者共有和特有的蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)行

7、GOfact超幾何分布分析，結(jié)果表明結(jié)構(gòu)分析活性和維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的蛋白質(zhì)在共有蛋白質(zhì)中顯著富集；而應(yīng)激反應(yīng)(壓力應(yīng)激、生命物刺激應(yīng)激和免疫應(yīng)激)和基因表達(dá)調(diào)控功能模塊在特有蛋白質(zhì)中富集。提示共有蛋白質(zhì)相對(duì)富集了一些恒定表達(dá)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，而特有蛋白質(zhì)則相對(duì)富集了一些調(diào)控型表達(dá)的蛋白質(zhì)或穿梭蛋白質(zhì)。 根據(jù)串聯(lián)質(zhì)譜的譜圖數(shù)對(duì)鑒定蛋白質(zhì)進(jìn)行半定量，已經(jīng)成為目前廣泛采用的蛋白質(zhì)定量方法之一，在此采用了一種基于期望值最大化(EM)校正過(guò)質(zhì)譜

8、譜圖計(jì)數(shù)的方法對(duì)所鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行量化。然后采用spearman相關(guān)的方法對(duì)其分別在粗面、滑面和胞漿中的定量分布進(jìn)行聚類。結(jié)果分別發(fā)現(xiàn)了一批與粗面、滑面和胞漿標(biāo)志性蛋白共聚類的蛋白質(zhì)，根掘Swiss-Prot的定位注釋分析，除部分已知定位于該細(xì)胞器的蛋白質(zhì)，還有大量的未知定位信息的蛋白質(zhì)分布其中，包括217個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中提示僅在轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)到的新蛋白質(zhì)。同時(shí)我們還意外的發(fā)現(xiàn)了4個(gè)與已知定位認(rèn)識(shí)不相符的蛋白質(zhì)，分別是Nmi、Ifi35、Cdk

9、5和Drg1，數(shù)據(jù)顯示，該類蛋白質(zhì)在共聚類分析中以高可信度定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(相關(guān)系數(shù)大于0.95，p<0.05)中，而據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)報(bào)道這些蛋白質(zhì)定位于胞漿中。我們采用了熒光共定位的方法，首批驗(yàn)證了Ifi35在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的定位。 本研究作為HLPP計(jì)劃中的一部分，首先對(duì)樣本保存方式及細(xì)胞器提取策略進(jìn)行了系統(tǒng)的比較和評(píng)價(jià)，在此基礎(chǔ)上所形成的凍存肝臟勻漿液備選保存方法和細(xì)胞器聯(lián)合提取技術(shù)方案已成為中國(guó)人類肝臟蛋白質(zhì)計(jì)劃中亞細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)

10、譜構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范(Standard operation procedure，SOP)。采用引入氣相分段掃描的三維(3-D)蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)策略和高于國(guó)際通用的數(shù)據(jù)卡值標(biāo)準(zhǔn)(大于95％置信度、雙肽段以上匹配)，我們分別從6，152、6,935個(gè)非冗余肽段中獲得了921和1065個(gè)高信度蛋白質(zhì)。通過(guò)對(duì)這些蛋白質(zhì)的定量和聚類分析，發(fā)現(xiàn)了217可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的未知功能蛋白質(zhì)和4個(gè)與已知定位認(rèn)識(shí)矛盾的蛋白質(zhì)，采用熒光共定位方法首批確證了If