東亞鉗蝎毒素ITX對C57BL-6小鼠Lewis肺癌生長及免疫功能的影響.pdf

1、背景：東亞鉗蝎(Buthus martensii Karsch，BMK)經(jīng)中藥制作方式后作為傳統(tǒng)的中藥材在我國應(yīng)用已有上千年歷史，其主要藥用部位是蝎尾，藥效成分是蝎毒。傳統(tǒng)驗(yàn)方中全蝎用于多種頑癥的治療。同時，祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為腫瘤的根源是邪毒瘀結(jié)、毒陷邪深，非攻不克，故常用有毒之品，而全蝎具有攻堅(jiān)蝕瘡、破瘀散結(jié)、消除腫塊的功效，因此常用于惡性腫瘤(癌癥)的治療。其實(shí)，中醫(yī)古典醫(yī)籍中并無現(xiàn)代醫(yī)學(xué)具體癌癥的確切稱謂，參照現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對具體癌癥的臨床表

2、現(xiàn)的描述，醫(yī)家將癌癥與中醫(yī)的某些癥候進(jìn)行對應(yīng)，但這種認(rèn)識方式具有一定的模糊性，鑒于此，為了驗(yàn)證古代醫(yī)籍中關(guān)于蝎毒的攻毒散結(jié)的記載是否就是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所謂的抗腫瘤效應(yīng)，近年來，國內(nèi)許多科學(xué)工作者利用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究方法對蝎毒的藥理作用進(jìn)行了廣泛的研究。大量體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明：蝎毒是一種高效低毒的生物制劑，對腫瘤兼有預(yù)防和治療的作用，甚至可以延長荷瘤小鼠的生存期，而且無毒性反應(yīng)；體外研究亦表明蝎毒對癌細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒性作用；一些研究人員更從免疫學(xué)的角

3、度探討了蝎毒的抗腫瘤效應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)：蝎毒的某些組分在增強(qiáng)免疫功能的同時能夠降低腫瘤放化療的毒副作用。 ITX(Immunotoxin)就是利用凝膠過濾層析法(Gel-filtration Chromatography)從BMK粗毒中分離出來的純化成分，在前期研究中發(fā)現(xiàn)：低劑量(1μg/L、0.1μg/L)的ITX可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，還可使荷瘤小鼠分泌TNF-a增加；近期體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示ITX能有效活化C57BL/6小鼠的

4、單核、B、NK和CD8+T細(xì)胞。其中，CD8+T和NK細(xì)胞本身就是清除機(jī)體腫瘤細(xì)胞的主要效應(yīng)細(xì)胞。而單核細(xì)胞作為專職的抗原呈遞細(xì)胞，它除了呈遞抗原給T細(xì)胞外，還可分泌IL-12等細(xì)胞因子，IL-12是一種在動物實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)的唯一可能具有抗瘤效應(yīng)的細(xì)胞因子，它可以誘導(dǎo)Th1細(xì)胞的分化，刺激T、NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，進(jìn)一步增強(qiáng)NK和CD8+T細(xì)胞的活性。加之傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代藥理對蝎毒抗腫瘤的文獻(xiàn)報(bào)道，本課題組設(shè)計(jì)了此研究方案。 目的

5、：本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)觀察蝎素ITX對C57BL/6小鼠Lewis肺癌生長、發(fā)展和體內(nèi)免疫狀況的影響，驗(yàn)證蝎毒是否真具有抗腫瘤的功效。 方法：將在體內(nèi)傳代保種的LLC(Lewis Lung Cancer)細(xì)胞接種到72只C57BL/6小鼠的右前腋下，在接種的第2天對小鼠進(jìn)行分組，即空白組，模型組，rIL-2-ip組，ITX-ip組和ITX-iv組，其中rIL-2.ip組為陽性對照組。用藥組連續(xù)用藥16天，空白組和模型組給

6、予相同體積的生理鹽水。用藥期間觀察比較各組小鼠的一般狀態(tài)，監(jiān)測瘤質(zhì)量和瘤體積的變化。末次給藥后，對40只小鼠摘眼球取血，用血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)法觀察小鼠外周血象的變化；利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測外周血中免疫細(xì)胞(單核、NK、B和CD8+T細(xì)胞)的活化情況，了解荷瘤小鼠的免疫狀態(tài)；采用酶免法檢測外周血中TGFB1的分泌情況，分析TGFB1對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響；在光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤和肺臟的炎性細(xì)胞的浸潤情況，探討免疫炎癥與腫瘤生長之間的關(guān)系。同時采

7、用免疫組化法檢測腫瘤組織中MHC-I、CD80、Fas和FasL分子的表達(dá)情況。余下的32只荷瘤小鼠進(jìn)行生存期的觀察。 結(jié)果：1．一般狀態(tài)：ITX-iv組小鼠的生存期最短，生存質(zhì)量最差，其他用藥組小鼠未見明顯的藥物毒副反應(yīng)。2．腫瘤生長：在用ITX與rIL-2實(shí)驗(yàn)組均看到接種的腫瘤生長更為快速，以ITX-ip組最明顯，尤其在接種的第14天以后。3．外周血象比較：由腫瘤競爭營養(yǎng)導(dǎo)致的紅細(xì)胞減少，以ITX-ip組表現(xiàn)得最為明顯，rI

8、L-2組次之，其余指標(biāo)的組間比較并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4．免疫細(xì)胞表型分析：與空白組相比，后四組的單核細(xì)胞和活化的單核細(xì)胞的總量均在增多，而NK、B和CD8+T細(xì)胞和活化的B和CD8+T細(xì)胞的總量在減少。ITX-iv組的NK細(xì)胞的量明顯比模型組增加(P<0.05)；用藥組的活化的NK和B細(xì)胞均明顯比模型組多(P<0.05)。5．TGFB1含量比較：用藥組小鼠的TGF-B1的含量均比模型組高(P<0.05)。6.病理學(xué)結(jié)果：在荷瘤小鼠的腫瘤間質(zhì)

9、或肺泡間隔，可見不同程度的炎細(xì)胞的浸潤，其中用藥組的炎細(xì)胞數(shù)均比模型組增多(P<0.05)，ITX實(shí)驗(yàn)組的炎細(xì)胞數(shù)比rIL-2組多(P<0.05)。7．免疫組化染色結(jié)果：組間MHC-1的表達(dá)并無明顯差異；而同樣是ITX，腹腔注射上調(diào)了CD80的表達(dá)，靜脈注射對CD80的影響不大；ITX-ip和rIL-2組Fas表達(dá)比模型組高(P<0.05)；ITX-ip組FasL表達(dá)比模型組高(P<0.05)，而rIL-2組FasL表達(dá)則比模型組低(P