人神經(jīng)生長(zhǎng)因子成熟肽在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)和活性測(cè)定.pdf

1、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)是神經(jīng)系統(tǒng)最重要的生物活性分子之一，兼有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與促進(jìn)神經(jīng)突起生長(zhǎng)雙重作用，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，是參與損傷神經(jīng)再生和功能修復(fù)的重要因子。同時(shí)，它還參與調(diào)節(jié)免疫和造血等非神經(jīng)系統(tǒng)的功能。 NGF在人體組織中含量極微，已有報(bào)導(dǎo)從胎盤中純化hNGF，但其組織來(lái)源有限，成本高產(chǎn)量低，不能滿足對(duì)hNGF的需求。利用基因工程方法獲得有生物學(xué)活性的hNGF

2、制品，對(duì)其基礎(chǔ)理論研究和臨床應(yīng)用具有重要的意義。Bac-to-Bac系統(tǒng)是一種新穎的桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)，構(gòu)建及篩選重組病毒比傳統(tǒng)的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)更為高效簡(jiǎn)單快捷，業(yè)已成為研究真核基因表達(dá)較為理想的工具。 本實(shí)驗(yàn)以帶有hNGF全長(zhǎng)肽基因的重組質(zhì)粒pFastBac-preproNGF為模板，擴(kuò)增出成熟肽β-NGF基因片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的轉(zhuǎn)移載體pFactBacl相連接，轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)胞，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體pF

3、astBac-pNGF并進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果正確后，提取該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入含有穿梭載體Bacmid的受體菌DH10Bac后發(fā)生轉(zhuǎn)座，得到含有hNGF成熟肽DNA的重組穿梭載體rBacmid-βNGF。再將這一重組穿梭載體轉(zhuǎn)染貼壁培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞Sf9，得到重組病毒rAcV-Bac-βNGF。經(jīng)鑒定正確后進(jìn)行昆蟲細(xì)胞Sf9的感染。分別將Sf9感染后培養(yǎng)上清和細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示感染細(xì)胞總蛋白在14.6kDa，左右有