急性心肌缺血早期降鈣素基因相關肽和神經(jīng)生長因子的表達.pdf

1、研究目的的：觀察神經(jīng)生長因子（NGF）、降鈣素基因相關肽（CGRP）在大鼠背根神經(jīng)節(jié)（DRG）、脊髓和心臟的分布；檢測大鼠冠狀動脈結扎后不同時點NGF、CGRP及其mRNA在DRG和心臟的表達變化，以及胸段硬膜外麻醉、NGF受體（TrkA）拮抗劑和乳鼠辣椒素預處理的干預效應。通過分析CGRP和NGF表達變化關系，探討在心肌缺血神經(jīng)源性反應中神經(jīng)肽表達的調(diào)節(jié)機制。研究背景景：已有的相關研究表明，CGRP等活性物質(zhì)參與機體對心血管系統(tǒng)功能的

2、調(diào)節(jié)。在發(fā)生急性心肌缺血時，心肌組織內(nèi)CGRP的含量明顯升高，提示CGRP 參與并影響急性心肌缺血的病理變化過程，目前關于其合成與釋放的調(diào)節(jié)機制尚不明確，其中NGF是最重要的調(diào)節(jié)因子。
　　 研究內(nèi)容及方法法：第一部分分：大鼠心臟和背根神經(jīng)節(jié)CGRP、NGF的組織化學研究實驗選用雄性SD大鼠隨機分為兩組：（1）正常對照組（NormAlgroup），麻醉后直接處死；（2）結扎冠狀動脈組（CAO group），單純扎閉冠狀動脈左前降

3、支。每組均為6只動物。采用熒光免疫組織化學和原位分子雜交技術觀察結扎冠脈后30min大鼠DRG、脊髓和心臟組織NGF及其受體TrkA、CGRP及其mRNA的表達部位；并應用銀染法檢測心臟神經(jīng)組織的分布。第二部分分：急性心肌缺血大鼠心肌組織和背根神經(jīng)節(jié)CGRP、NGF的表達動物隨機分為兩組：（1）手術對照組（Sham group），只開胸暴露心臟，不結扎冠脈；（2）結扎冠狀動脈組（CAO group）。每組又分15min、30min、1h

4、和6h 四個時點（n=6）。通過心電圖監(jiān)測和TTC 染色判斷心肌缺血模型制備成功；采用ELISA和實時熒光Rt-PCR方法定量檢測結扎冠脈后不同時點大鼠胸段DRG和缺血心肌組織NGF、CGRP及其mRNA的表達變化。第三部分分：胸段硬膜外神經(jīng)阻滯效應的研究動物隨機分為三組：（1）手術對照組（Sham group）；（2）結扎冠狀動脈組（CAO group）；（3）羅哌卡因硬膜外麻醉組（EA group）。每組又分15min、30min、

5、1h和6h 四個時點（n=6）。在結扎左冠狀動脈前15min經(jīng)胸段硬膜外給予1％ 羅哌卡因120μg.kg-1或生理鹽水。采用ELISA和實時熒光Rt-PCR 方法從蛋白和mRNA水平定量分析胸段硬膜外麻醉對NGF、CGRP及其mRNA表達的干預效應。第四部分分：TrkA 受體拮抗劑及辣椒素干預效應的研究1、動物隨機分為三組（n=6）：（1）手術對照組（Sham group）；（2）結扎冠狀動脈組（CAO group）；（3）AG879

6、 硬膜外給藥組（AG879 group）。在結扎左冠狀動脈前15min經(jīng)胸段硬膜外給予AG879（10-7mol/L）或生理鹽水。2、動物隨機分為四組（n=6）：（1）正常大鼠手術對照組（Normal-Sham group）；（2）正常大鼠結扎冠狀動脈組（Normal-CAO group）；（3）去神經(jīng)大鼠手術對照組（Denervated-Sham group）；（4）去神經(jīng)大鼠結扎冠狀動脈組（Denervated-CAO group）

7、。雄性SD乳鼠辣椒素50mg/kg皮下注射制備去感覺神經(jīng)模型，測定甩尾反射潛伏期和心重/體重百分比鑒定模型成功。采用ELISA和實時熒光Rt-PCR 方法從蛋白和mRNA水平定量分析TrkA 受體拮抗劑和乳鼠辣椒素預處理對NGF、CGRP及其mRNA表達的干預效應（根據(jù)第二部分實驗結果，選取CAO后15min進行mRNA擴增，CAO后30min進行蛋白定量）。
　　 結果：1、HE染色顯示心內(nèi)神經(jīng)節(jié)的完整形態(tài)，神經(jīng)組織銀染觀察到

8、發(fā)達的神經(jīng)纖維密布于心房肌和心外膜下。2、CGRP 主要分布于脊髓背角淺層、心外膜、心房組織及血管內(nèi)皮，DRG內(nèi)CGRP及其mRNA主要表達于中、小直徑神經(jīng)元，心臟CGRP 自身合成較弱。3、在心臟、脊髓和DRG內(nèi)均有NGF及其受體TrkA的分布，尤其在心臟NGF免疫陽性細胞位于心肌間隙、心外膜、脂肪組織和血管壁外層。4、在缺血心肌組織和DRG，與相應時點sham組比較，CAO組CGRP蛋白含量明顯升高（P<0.05）；與相應時點sha

9、m組比較，CAO組背根神經(jīng)節(jié)β-CGRP mRNA的表達在15min明顯降低（P＜0.05），而α-CGRP mRNA在6h 顯著升高（P＜0.05）。5、在缺血心肌組織，與相應時點sham組比較，CAO組NGF蛋白含量顯著升高（P<0.05），在6h時NGF mRNA的表達明顯上調(diào)（P＜0.05）；在DRG，CAO組NGF蛋白含量升高僅在1h時有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而NGF mRNA的表達隨時間延長顯著下調(diào)（P<0.05）。6

10、、EA能顯著抑制CAO 誘導的DRG和缺血心肌組織CGRP和NGF蛋白含量的增高（P<0.05），在15min時可以部分逆轉(zhuǎn)背根神經(jīng)節(jié)β-CGRP mRNA的下調(diào)（P＜0.05），并且在6h時顯著降低背根神經(jīng)節(jié)CGRP mRNA和NGF mRNA的表達（P＜0.05）；EA對心臟NGF mRNA有上調(diào)趨勢（P>0.05）。7、硬膜外給予AG879 可以顯著降低背根神經(jīng)節(jié)CGRP mRNA的表達（P＜0.05），對CGRP蛋白有下調(diào)趨勢，

11、但無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。8、與正常大鼠比較，辣椒素去感覺神經(jīng)大鼠甩尾反射潛伏期明顯延長（P<0.01），心重/體重百分比顯著降低（P<0.05）。辣椒素去感覺神經(jīng)可以明顯降低成年大鼠CGRP及其mRNA的表達（P＜0.05），顯著升高NGF蛋白含量（P<0.05）。
　　 結論：1、NGF和CGRP在成年大鼠心臟和DRG均有表達，CGRP 合成主要來源于神經(jīng)組織。2、急性心肌缺血早期，胸段DRG和缺血心肌組織CGRP、N