細(xì)胞損傷早期線粒體裂解的時(shí)間曲線及環(huán)孢素A對(duì)線粒體膜穩(wěn)定作用的初步探討.pdf

1、目的：創(chuàng)傷導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征,甚至發(fā)生多器官功能衰竭。全身炎癥反應(yīng)綜合征的發(fā)病機(jī)制及防治至今仍未完全了解。現(xiàn)已有許多實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)當(dāng)機(jī)體損傷時(shí),組織細(xì)胞破裂,線粒體釋放入循環(huán)系統(tǒng),待線粒體裂解后,大規(guī)模激發(fā)炎癥反應(yīng),繼而發(fā)生SIRS,甚至引發(fā)MODS。由于線粒體是一種穩(wěn)定的膜細(xì)胞器,它在機(jī)體損傷后,多長時(shí)間會(huì)由細(xì)胞內(nèi)釋放出來,多長時(shí)間會(huì)裂解,現(xiàn)在還都不清楚。本實(shí)驗(yàn)將試圖揭示細(xì)胞損傷早期線粒體釋放入血后的裂解時(shí)間曲線,同時(shí)觀察細(xì)

2、胞膜保護(hù)藥物環(huán)孢霉素A對(duì)線粒體膜穩(wěn)定作用的效果。
　　方法：本研究在細(xì)胞水平、分子水平,探索線粒體膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,以及抑制線粒體膜裂解的方法,作為一種源頭性抑制損傷相關(guān)分子模式啟動(dòng)失控性SIRS的機(jī)制,從分子、細(xì)胞展開研究,闡明細(xì)胞損傷后線粒體釋放入血,其膜破裂的時(shí)間變化曲線及其抑制因素。并將線粒體作為一種預(yù)警機(jī)制引入損傷控制外科學(xué),探索機(jī)體嚴(yán)重創(chuàng)傷后SIRS防治新靶點(diǎn)。
　　第一部分:取6g新鮮大鼠肝臟組織,分別用蔗糖法和

3、試劑盒法提取3g大鼠肝臟組織中的線粒體,從線粒體提取純度來評(píng)價(jià)線粒體提取質(zhì)量,探索適合于我們線粒體實(shí)驗(yàn)研究的大鼠肝臟細(xì)胞線粒體的提取方法,同時(shí)也為線粒體提取質(zhì)量的評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第二部分:將新鮮大鼠線粒體從大鼠肝臟中提取出來,利用MAO的濃度表示線粒體的濃度,將MAO濃度為200U/ml的線粒體懸液5ml置于20ml大鼠血清中培養(yǎng),12小時(shí)內(nèi)在不同時(shí)間點(diǎn)(每半小時(shí)一次)測定培養(yǎng)基中MAO、COX及MDH的含量。觀察線粒體膜

4、和基質(zhì)中各自特異性酶的含量時(shí)間變化曲線,分析線粒體膜裂解高峰出現(xiàn)的時(shí)間。
　　第三部分:再次從大鼠肝臟中將新鮮大鼠線粒體提取出來,將MAO濃度為200U/ml的線粒體懸液5ml置于20ml大鼠血清中培養(yǎng),同時(shí)加用1ml100mg/ml的環(huán)孢霉素A藥物對(duì)線粒體膜進(jìn)行保護(hù),仍在12小時(shí)內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)(每半小時(shí)一次)測定培養(yǎng)基中線粒體內(nèi)膜和基質(zhì)中各自特異性酶COX及MDH的濃度。設(shè)置對(duì)照組,加入1ml生理鹽水。同時(shí)測定兩組的濃度時(shí)間變化曲

5、線,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,觀察該藥物對(duì)線粒體膜破裂是否有明確抑制作用。
　　結(jié)果：
　　1、試劑盒法和蔗糖法分別提取的線粒體琥珀酸脫氫酶和酸性磷酸酶的純化倍數(shù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),但蔗糖法提取的線粒體堿性磷酸酶的純化倍數(shù)大于試劑盒法,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。即使用組織線粒體分離試劑盒提取的線粒體的細(xì)胞膜污染較使用蔗糖法提取的小,更適合用于今后實(shí)驗(yàn)所需要的提取線粒體步驟中。
　　2、線粒體離體培養(yǎng)時(shí)COX和MD

6、H的濃度分別在3小時(shí)、3.5小時(shí)到達(dá)峰值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明培養(yǎng)液中MAO的濃度隨著時(shí)間的變化沒有明顯改變,但COX和MDH的含量會(huì)隨著時(shí)間的延長逐漸增加,到達(dá)波峰,再平緩下降。由此可知完整線粒體由細(xì)胞中釋放出來后大約3.5小時(shí)達(dá)到裂解的峰值。
　　3、對(duì)照組中COX、MDH峰值出現(xiàn)于3小時(shí)、3.5小時(shí),峰值分別為1.384U/l,34.568U/l;實(shí)驗(yàn)組中COX、MDH峰值出現(xiàn)于6小時(shí)、6.5小時(shí),峰值分別為1.376U/l,31.