甲狀腺激素對(duì)線粒體轉(zhuǎn)位酶表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　甲狀腺激素(TH)主要通過調(diào)節(jié)核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄來調(diào)控線粒體功能。研究發(fā)現(xiàn)線粒體結(jié)構(gòu)和功能蛋白的輸入對(duì)維持其正常功能非常重要，此過程是由位于內(nèi)外膜上的線粒體轉(zhuǎn)位酶介導(dǎo)的。近年來的研究表明TH對(duì)橫紋肌線粒體轉(zhuǎn)位酶具有調(diào)控作用，因此本課題的研究立足于TH對(duì)神經(jīng)組織線粒體轉(zhuǎn)位酶表達(dá)的影響，采用神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系體外培養(yǎng)技術(shù)、并制備碘缺乏小鼠模型，檢測TH是否神經(jīng)母細(xì)胞瘤及小鼠大腦中轉(zhuǎn)位酶表達(dá)的改變。同時(shí)選取心肌細(xì)胞系體外培養(yǎng)，通過

2、對(duì)心肌細(xì)胞及小鼠心臟中轉(zhuǎn)位酶表達(dá)情況的分析，比較TH對(duì)兩種組織作用的異同。本課題的研究將對(duì)線粒體功能異常所致疾病，如Parkinson's病、遺傳性Alzheimer's病、代謝綜合癥等發(fā)病機(jī)理的揭示具有參考價(jià)值。
　　方法：
　　1、本實(shí)驗(yàn)選用離乳Balb/c小鼠，雌雄各半。小鼠根據(jù)性別和體重按完全隨機(jī)分組法分為2組，每組60只。正常組(NC):飲去離子水，普通飼料喂養(yǎng);低碘組(LI):飲去離子水，低碘飼料喂養(yǎng)，每日碘攝入

3、量約為0.25μg/d。飼養(yǎng)3個(gè)月后，每個(gè)組各取20只處死取材。飼養(yǎng)6個(gè)月后，LI組中隨機(jī)取15只小鼠，隨機(jī)分為3組（每組5只），分別給予注射T3（100μg/kg，每日一次）24h、48h、72h，處死全部小鼠。
　　2、用化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CIA)檢測小鼠血清中TSH、TH水平，并檢測大腦及心臟局部TH水平。SYBR GREEN實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測大腦及心臟中線粒體轉(zhuǎn)位酶Tom40及Tim23mRNA的表達(dá)情況，W

4、estern blot法檢測Tom40及Tim23蛋白的表達(dá)。
　　3、常規(guī)體外培養(yǎng)LA-N-5神經(jīng)母細(xì)胞瘤和H9C2心肌細(xì)胞，無血清饑餓后，給予不同濃度的T3、T4以及T2作用持續(xù)不同時(shí)程，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測兩種細(xì)胞系的Tom40及Tim23mRNA的表達(dá)情況;Western blot法檢測Tom40及Tim23蛋白的表達(dá);熒光探針JC-10法檢測線粒體膜電位的變化。
　　結(jié)果：
　　1、低碘飲食飼養(yǎng)3個(gè)

5、月，LI組小鼠血清TT4、TT3、FT4、FT3[(0.47±0.70)nmol/L、（2.41±0.28）pmol/L、（0.76±0.08）nmol/L、（4.01±0.40）pmol/L]顯著低于NC組小鼠[（55.2±3.68）nmol/L、（32.72±1.02）pmol/L、（1.10±0.06）nmol/L、（5.40±0.38）pmol/L，P＜0.001];LI組小鼠TSH（35.67±17.39）mIU/L明顯高于N

6、C組（0.24±0.105）mIU/L，P＜0.001:
　　2、低碘飼養(yǎng)6個(gè)月，LI組小鼠血清TT4、FT4[（4.60±2.62）nmol/L、（4.72±0.78）pmol/L]顯著低于NC組小鼠[（46.74±10.22）nmol/L、（28.80±4.81）pmol/L，P＜0.001];與NC組小鼠[（0.92±0.15）nmol/L、（4.59±0.34）pmol/L]相比，TT3、FT3[（1.02±0.21）nm

7、ol/L、（5.23±0.87）pmol/L]差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;LI組小鼠TSH（3.22±4.68）mIU/L明顯高于NC組（0.08±0.03）mIU/L，P＜0.001:
　　3、注射T3后TT4、TT3、FT4、FT3逐漸上升，24h開始高于LI組，48h恢復(fù)到NC水平，72h高于NC組水平。TSH在24h（2.44±2.60）就回落到了NC組水平(0.08±0.03)，P=0.074。
　　4、低碘3個(gè)月時(shí)，小鼠大

8、腦的線粒體轉(zhuǎn)位酶Tom40和Tim23mRNA表達(dá)降低至NC組的0.006倍和0.48倍;Tom40蛋白表達(dá)也下調(diào)至NC組的0.82倍。小鼠心臟的轉(zhuǎn)位酶Tom40和Tim23mRNA表達(dá)也低于NC組，分別下降至NC組的0.41倍和0.81倍;Tom40蛋白表達(dá)也下降至NC組的0.68倍。
　　5、低碘6個(gè)月時(shí)，小鼠大腦的Tom40和Tim23mRNA及蛋白表達(dá)還持續(xù)低于正常水平，心臟轉(zhuǎn)位酶的基因及蛋白表達(dá)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。注射T3

9、后，兩個(gè)器官中兩類轉(zhuǎn)位酶的表達(dá)都上升，只是心臟的程度更強(qiáng)。
　　6、不同濃度的T3引起LA-N-5細(xì)胞系的線粒體轉(zhuǎn)位酶Tom40和Tim23的基因表達(dá)增加;細(xì)胞總蛋白、線粒體蛋白及胞漿蛋白中Tom40和Tim23的表達(dá)都增加，其增加趨勢(shì)隨著T3濃度的升高而上升。然而不同濃度的T4均不引起LA-N-5細(xì)胞系Tom40和Tim23表達(dá)的明顯改變。
　　7、不同濃度的T3引起H9C2心肌細(xì)胞系線粒體轉(zhuǎn)位酶Tom40蛋白表達(dá)不同程度

10、的增加。
　　結(jié)論：
　　1、低碘飲食，TH合成原料不足，血清TH下降、TSH水平升高，表現(xiàn)為經(jīng)典的HPT軸調(diào)控。
　　2、長期碘缺乏時(shí)，大腦組織線粒體轉(zhuǎn)位酶的表達(dá)下降，給予外源性T3注射后，轉(zhuǎn)位酶的表達(dá)開始回升。提示TH對(duì)腦組織線粒體轉(zhuǎn)位酶的表達(dá)有調(diào)控作用。
　　3、外源性T3同樣能夠上調(diào)心臟線粒體轉(zhuǎn)位酶的表達(dá)，其程度比大腦更甚。這是由于腦組織存在TH轉(zhuǎn)運(yùn)體及脫碘酶活性調(diào)控等多種調(diào)節(jié)機(jī)制，心肌則直接利用循環(huán)中的