腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥機(jī)制研究.pdf

1、目的：本研究通過(guò)對(duì)86株碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥或敏感性降低的腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行β-內(nèi)酰胺酶、外膜蛋白和外排泵檢測(cè)，旨在闡明腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥的分子機(jī)制；通過(guò)碳青霉烯酶基因周?chē)蛄蟹治?，探討碳青霉烯耐藥基因的傳播機(jī)制。
　　 方法：瓊脂稀釋法測(cè)定抗生素對(duì)細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC)。脈沖場(chǎng)凝膠電泳和腸桿菌基因間重復(fù)性一致序列-PCR(ERIC-PCR)分析菌株之間的同源性。等電聚焦電泳、PCR擴(kuò)增和序列分析確定菌株所產(chǎn)

2、β-內(nèi)酰胺酶的類(lèi)型。質(zhì)粒接合試驗(yàn)、質(zhì)粒消除試驗(yàn)和Southern blot雜交驗(yàn)證碳青霉烯耐藥基因是否位于質(zhì)粒上。提取細(xì)菌的外膜蛋白作十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，檢測(cè)外膜蛋白表達(dá)情況。羰酰氰氯苯腙(CCCP)抑制試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)菌中是否存在針對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素的外排泵。用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ對(duì)碳青霉烯酶基因編碼質(zhì)粒進(jìn)行酶切分型。對(duì)部分碳青霉烯酶基因編碼質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，分析碳青霉烯酶基因周?chē)鶧NA序列的基

3、因結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果：86株菌株對(duì)碳青霉烯有不同程度的耐藥，亞胺培南、美羅培南和厄他培南的敏感率分別為43.0％、44.2％和1.2％，其它β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素和環(huán)丙沙星的耐藥率和耐藥水平均很高，多粘菌素B的敏感率最高(92.9％)，阿米卡星次之(80.2％)。同一醫(yī)院內(nèi)的菌株多數(shù)具有同源性，存在克隆傳播現(xiàn)象。82株菌株產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶，5株產(chǎn)IMP型金屬β-內(nèi)酰胺酶（其中3株同時(shí)產(chǎn)KPC-2），2株檢測(cè)不到碳青霉烯酶。T

4、EM-1、SHV-11/-12和CTX-M-14/-M-3等β-內(nèi)酰胺酶的檢出率非常高，大部分菌株同時(shí)產(chǎn)多種酶。大多數(shù)菌株可通過(guò)接合試驗(yàn)將碳青霉烯耐藥性傳遞給大腸埃希菌。Southern blot雜交顯示blaKPC-2基因位于50kb的可接合質(zhì)粒上。4株肺炎克雷伯菌（包括2株檢測(cè)不到碳青霉烯酶的菌株）由于ompK36基因中存在插入序列或堿基突變而缺失OmpK36膜孔蛋白，一株陰溝腸桿菌缺失一個(gè)38kDa的外膜蛋白，弗勞地檸檬酸桿菌的兩

5、個(gè)外膜蛋白表達(dá)量均明顯下降。CCCP不能降低亞胺培南對(duì)細(xì)菌的MIC值。
　　 82株產(chǎn)KPC-2菌株的blaKPC-2基因編碼質(zhì)?？筛鶕?jù)EcoRⅠ和HindⅢ的限制性酶切圖譜分為11種類(lèi)型（Ⅰ型-Ⅺ型），大部分質(zhì)粒(62/82)為Ⅰ型，其次為V型(8/82)。選?、裥?pKP1)和V型(pKP20)質(zhì)粒各一個(gè)進(jìn)行測(cè)序，pKP1質(zhì)粒獲得7788bp的DNA序列，pKP20為6000bp。兩個(gè)質(zhì)粒的blaKPC-2基因周?chē)蛄兄芯?/p>

6、有多個(gè)轉(zhuǎn)座相關(guān)元件。pKP1質(zhì)粒依次編碼Tn3轉(zhuǎn)座酶、Tn3解離酶、ISKpn8轉(zhuǎn)座酶、KPC-2和ISKpn6-like樣轉(zhuǎn)座酶等蛋白。pKP20質(zhì)粒依次編碼IS26轉(zhuǎn)座酶、Tn3解離酶截短蛋白、ISKpn8轉(zhuǎn)座酶、KPC-2、ISKpn6樣轉(zhuǎn)座酶截短蛋白和IS26轉(zhuǎn)座酶等，其中Tn3解離酶截短蛋白、ISKpn8轉(zhuǎn)座酶、KPC-2和ISKpn6樣轉(zhuǎn)座酶截短蛋白基因等部分與pKP1質(zhì)粒相同（共3354bp）。根據(jù)pKP1和pKP20質(zhì)粒

7、的DNA序列設(shè)計(jì)引物對(duì)其它80個(gè)blaKPC-2基因編碼質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，大部分質(zhì)粒(69/82)的PCR擴(kuò)增結(jié)果與pKP1質(zhì)粒相同，8個(gè)V型質(zhì)粒的PCR結(jié)果與pKP20質(zhì)粒相同。除3個(gè)質(zhì)粒外，其余質(zhì)粒均具有共同的3354bp序列。另外2個(gè)質(zhì)粒中檢測(cè)到了2種變異體。
　　 結(jié)論：同一家醫(yī)院內(nèi)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥的腸桿菌科細(xì)菌主要以克隆株的形式傳播。碳青霉烯酶尤其是KPC-2的產(chǎn)生是腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯耐藥的主要原因，碳青