碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌的耐藥機(jī)制及其所致醫(yī)院感染控制研究.pdf

1、腸桿菌科細(xì)菌包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、弗勞地檸檬酸桿菌和陰溝腸桿菌等,是引起醫(yī)院感染最常見的病原菌。據(jù)歷年上海地區(qū)和CHlNET全國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示,腸桿菌科細(xì)菌占所有革蘭陰性菌的60-70％。碳青霉烯類抗生素包括亞胺培南、美羅培南和厄他培南等是臨床治療腸桿菌科細(xì)菌尤其是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)及AmpC酶等多重耐藥菌株引起感染的最有效的抗菌藥物。然而,隨著碳青霉烯類抗生素在臨床上的廣泛應(yīng)用,耐藥腸桿菌科細(xì)菌(Car

2、bapenem-ResistantEnterobacteriaceae,CRE)正在醫(yī)院內(nèi)悄悄出現(xiàn)。如在大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中的耐藥率也已經(jīng)由早年的零上升到1％;在腸桿菌科的其他一些菌屬已經(jīng)有7.0％的耐藥率。在非發(fā)酵菌的某些菌屬的耐藥率也已經(jīng)上升為20％～30％。由于大多數(shù)對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的細(xì)菌同時(shí)也對(duì)許多臨床常用的抗生素耐藥,成為泛耐藥菌株,對(duì)病人的生命構(gòu)成極大的威脅。該類藥物在臨床的應(yīng)用受到嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。
　　對(duì)20

3、05年—2009年華山醫(yī)院所有分離的CRE菌株臨床資料的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),同一病床的不同時(shí)間入院患者均能分離到CRE菌株,如神經(jīng)外科病房的某一床位,2005年8月、2006年1月、2007年3月和2007年9月分別從四位不同的患者分離到碳青霉烯類抗生素耐藥的菌株,包括3株弗勞地檸檬酸桿菌和1株肺炎克雷伯菌;同一患者亦能分離到不同菌屬的CRE菌株,如鮑曼不動(dòng)桿菌和肺炎克雷伯菌組、弗勞地檸檬酸桿菌和肺炎克雷伯菌組、肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌組等。

4、因此,我們推測(cè)CRE菌株在醫(yī)院范圍內(nèi)廣泛播散的機(jī)制主要有以下兩種:①水平傳播:攜帶碳青霉烯酶如KPC-2型酶的質(zhì)粒在不同細(xì)菌間進(jìn)行直接轉(zhuǎn)移;使敏感株成為耐藥株;②克隆傳播:CRE菌株通過各種方式在不同患者間克隆傳播而導(dǎo)致醫(yī)院感染暴發(fā)流行的發(fā)生。盡管CRE菌株已逐年增加且呈暴發(fā)流行的趨勢(shì),但目前國(guó)內(nèi)的的研究大多集中于耐藥機(jī)制的研究,對(duì)該類菌株如何在不同種屬細(xì)菌間廣泛播散的傳播機(jī)制尚缺乏深入的研究,對(duì)該類菌株引起的醫(yī)院感染的危害性亦未得到足

5、夠的重視。Kochar等人通過加強(qiáng)手衛(wèi)生和環(huán)境表面消毒成功減少碳青霉烯類抗生素耐藥的肺炎克雷伯苗的傳播。但有關(guān)此方面的研究國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。由于CRE菌株引起的感染大多為重癥感染且目前臨床并無有效的治療藥物可供選擇,尤其是對(duì)于CRE菌株引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染更是如此。與往年相比,2009年碳青霉烯類抗生素耐藥肺炎克雷伯菌的發(fā)生率在快速的上升,如再不采取有效的醫(yī)院感染控制措施加以控制,該類菌株引起的大爆發(fā)流行所給患者帶來的災(zāi)難性后果將不可避

6、免。因此,了解CRE菌株在不同種屬細(xì)菌間廣泛播散的機(jī)制,采取有效的措施控制該類菌株引起的醫(yī)院感染的發(fā)生及暴發(fā)流行已是迫在眉睫。本課題旨在通過分子生物學(xué)技術(shù)與臨床流行病學(xué)調(diào)查相結(jié)合的方式揭示CRE菌株在不同種屬細(xì)菌間廣泛播散的機(jī)制,為采取行之有效的醫(yī)院感染控制措施以及時(shí)遏制該類菌株引起的持續(xù)感染和暴發(fā)流行提供實(shí)驗(yàn)室和臨床依據(jù),這對(duì)促進(jìn)臨床抗感染治療的合理用藥以及患者的康復(fù)將產(chǎn)生積極的影響,同時(shí)也將帶來極人的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。本研究?jī)?nèi)容共

7、包括以下四部分。
　　第一部分，碳青霉烯類藥物耐藥菌株的篩選及藥敏試驗(yàn)
　　細(xì)菌產(chǎn)生碳青霉烯酶是CRE菌株對(duì)碳青霉烯類耐藥的主要機(jī)制之一,文獻(xiàn)報(bào)道,該類菌株還可產(chǎn)生超廣譜β內(nèi)酰胺酶(Extended-Spectrumβ-lactamases,ESBLs)和/或AmpC酶合并外膜孔蛋白缺失等。為檢測(cè)腸桿菌科細(xì)菌中的碳青霉烯酶,美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CIinicaILaboratoryStandardInstitute,C

8、LSI)于2009年推薦了改良Hodge試驗(yàn),用于腸桿菌科細(xì)菌中碳青霉烯酶的檢測(cè)。該法最初是由Wavellhodge建立的一種用于檢測(cè)產(chǎn)青霉素酶淋病奈瑟菌的試驗(yàn)。之后多位學(xué)者用此方法或進(jìn)行改良用于銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌中金屬酶的檢測(cè)以及大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中的CMY-1型AmpC酶的檢測(cè)。
　　華山醫(yī)院于2005年首次出現(xiàn)CRE菌株,隨后我們通過細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)系統(tǒng)連續(xù)對(duì)此類菌株的出現(xiàn)進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。2005年1月-2009年12

9、月間我們共分離到220株對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的腸桿菌科細(xì)菌,包括克雷伯菌屬161株(其中肺炎克雷伯菌158株,產(chǎn)酸克雷伯菌3株)、檸檬酸桿菌屬41株(其中弗勞地檸檬酸桿菌35株,其他檸檬酸桿菌6株)、大腸埃希菌6株、陰溝腸桿菌4株、奇異變形桿菌3株、粘質(zhì)沙雷菌2株、產(chǎn)氣腸桿茼1株、支氣管博得特菌1株和斯氏普羅威登菌1株。紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,2005年-2008年華山醫(yī)院臨床分離的肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南、美羅培南和厄他培南等抗菌

10、藥的耐藥率在2％以下,但2009年快速上升至16％左右;弗勞地檸檬酸桿菌2005年對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥率在10％,2006年快速上升至45％左右,2007年-2009年維持在35％左右。瓊脂稀釋法檢測(cè)2005年-2009年中的78株CRE菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)亞胺培南、美羅培南、厄他培南和粘菌素的敏感率分別為16.4％、17.9％、1.3％和96.0％。上述藥物對(duì)78株CRE菌株的MIC50/MIC90分別為32/256mg/L

11、、64/＞256mg/L、128/＞256mg/L和1/1mg/L。改良Hodge試驗(yàn)對(duì)78株CRE菌株中的碳青霉烯酶進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示:93.6％(73/78)的菌株為陽性,提示這些菌株可能產(chǎn)碳青霉烯酶。
　　第二部分，碳青霉烯類藥物耐藥菌株的耐藥機(jī)制及同源性分析
　　采用PCR法對(duì)78株CRE菌株進(jìn)行了各種碳青霉烯酶基因、ESBLs和質(zhì)粒AmpC酶基因的檢測(cè)及DNA測(cè)序結(jié)果顯示,33.3％(26/78)的菌株產(chǎn)KPC-

12、2型碳青霉烯酶,且其中分別有7.7％(2/26)、7.7％(2/26)、3.8％(1/26)的菌株同時(shí)伴有VIM-1、IMP-2和IMP-1型金屬酶。6.4％(5/78)、5.1％(4/78)、3.8％(3/78)、6.4％(5/78)和12.8％(10/78)的菌株分別產(chǎn)VIM-1、IMP-1、IMP-2、GIM和OXA-69型碳青霉烯酶基因。多重PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,20.5％(16/78)的菌株產(chǎn)OXA-23like、OXA-51l

13、ike或OXA-58like型碳青霉烯酶。VIM-2、SPM、NMC、IMI、IND、OXA-48、OXA-50、OXA-55、OXA-60和OXA-24like碳青霉烯酶基因檢測(cè)結(jié)果全為陰性。
　　PFGE同源性分析:按Tenover標(biāo)準(zhǔn),25株弗勞地檸檬酸桿菌分為3種不同的DNA譜型(A-C),其中15株產(chǎn)KPC-2型酶的菌株為同一譜型(A),提示存在克隆菌株傳播流行可能。43株肺炎克雷伯菌分為10個(gè)不同的DNA譜型(A-J)

14、,9株產(chǎn)KPC-2型酶菌株中7株為同一譜型(J),其余2株為同一譜型(I);不產(chǎn)KPC-2型酶的CRE菌株間亦存在克隆菌株的傳播流行。
　　外膜孔蛋白分析:SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,與敏感菌株相比,29.5％(23/78)的CRE菌株至少缺失OmpK35和OmpK36中的1條或兩者全部缺失,60.3％(47/78)的菌株外膜孔蛋白均存在表達(dá)下降現(xiàn)象,提示外膜蛋白在CRE菌株對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥過程中發(fā)揮了重要作用。
　

15、　接合試驗(yàn):對(duì)產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶基因的6株肺炎克雷伯菌(其中2株同時(shí)產(chǎn)VIM-1型金屬酶)和3株弗勞地檸檬酸桿菌的接合試驗(yàn)結(jié)果顯示,所有9株細(xì)菌均在選擇性平板上獲得轉(zhuǎn)移接合子。藥敏試驗(yàn)及β內(nèi)酰胺酶基因PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,供體菌中所含的ESBL基因均成功轉(zhuǎn)移至受體菌中,轉(zhuǎn)移接合子均表現(xiàn)為對(duì)第三代頭孢菌素耐藥。但KPC-2型碳青霉烯酶或VIM-1型金屬酶基因均未能從供體菌轉(zhuǎn)移至受體菌。轉(zhuǎn)化試驗(yàn)亦未能將此兩種碳青霉烯酶基因轉(zhuǎn)移至受體菌,

16、推測(cè)該耐藥基因可能位于染色體上,或可能含有KPC-2型碳青霉烯酶基因的質(zhì)粒過大而導(dǎo)致接合或轉(zhuǎn)化試驗(yàn)失敗。
　　第三部分，碳青霉烯類藥物耐藥菌株的流行病學(xué)調(diào)查研究
　　同一病床的不同時(shí)間入院患者均能分離到CRE菌株,同一患者亦能分離到不同種屬的CRE菌株,以及在某些患者身上,經(jīng)?？吹竭@樣一種現(xiàn)象:最初分離的肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類抗生素是敏感的,但經(jīng)過一段時(shí)間的治療后變得對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥。為在體外模擬體內(nèi)菌株出現(xiàn)的上述現(xiàn)

17、象,我們采用接合試驗(yàn)嘗試對(duì)這一演變過程進(jìn)行復(fù)制,以期能夠初步解釋CRE菌株在不同種屬細(xì)菌間廣泛播散的現(xiàn)象。本研究對(duì)同一患者臨床分離的泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌A1979和碳青霉烯類敏感的肺炎克雷伯菌K1980進(jìn)行了接合試驗(yàn),利用厄他培南和舒巴坦作為接合子菌株篩選藥物,成功篩選到了鮑曼不動(dòng)桿菌A1979和肺炎克雷伯菌K1980菌株的接合子,藥敏試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)接合子菌株對(duì)厄他培南、亞胺培南和美羅培南均表現(xiàn)為耐藥。ERIC-PCR和PFGE試驗(yàn)均證實(shí)對(duì)

18、碳青霉烯類藥物抗生素耐藥的接合子菌株與敏感的受體菌的ERIC-PCR和PFGE譜型完全一致。由于此次選擇的供體菌鮑曼不動(dòng)桿菌A1979其產(chǎn)金屬酶的種類尚未知曉,因此接合子菌株中含有哪一種金屬酶基因仍有待進(jìn)一步的研究。在后續(xù)的進(jìn)一步研究中,我們將選擇更多的菌株進(jìn)行類似的直接的接合試驗(yàn)。并對(duì)接合試驗(yàn)所獲得的接合子菌株以及供體菌和受體菌中的耐藥質(zhì)粒DNA分別進(jìn)行測(cè)序分析,以從分子生物學(xué)水平解釋碳青霉烯酶在不同種屬細(xì)菌問轉(zhuǎn)移的機(jī)制。
　　

19、我們對(duì)神經(jīng)外科病房某一床位進(jìn)行了調(diào)查。該床位頻繁地住過CRE菌株感染患者或定植者。采用含1片厄他培南(10μg)紙片的5毫升MH肉湯的增菌法從患者肛周標(biāo)本、尿道口標(biāo)本以及氧氣濕化瓶中的水樣標(biāo)本中均分離到了對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的肺炎克雷伯菌。PFGE同源性分析證實(shí)分離自這3份標(biāo)本中的3株菌株為同一PFGE譜型。同時(shí)采集該病房7位患者床頭的氧氣濕化瓶中的水樣標(biāo)本,結(jié)果發(fā)現(xiàn)從其中5名患者的濕化瓶水樣中分離出了對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的菌株,包

20、括2株肺炎克雷伯菌、3株鮑曼不動(dòng)桿菌和1株嗜麥芽窄食單胞菌等。而對(duì)神經(jīng)外科某一病房的環(huán)境標(biāo)本及工作人員的一次集中采樣篩選CRE菌株結(jié)果顯示,病床左右欄桿及桌子臺(tái)面的環(huán)境標(biāo)本,護(hù)士的手上以及輸液泵屏幕上均存在碳青霉烯類藥物耐藥的肺炎克雷伯菌。提示氧氣濕化瓶和醫(yī)院環(huán)境中存在的CRE菌株可能是在醫(yī)院環(huán)境中引起各種感染尤其是呼吸道感染的關(guān)鍵傳播源頭之一。
　　第四部分，碳青霉烯類藥物耐藥菌株的病史資料分析
　　對(duì)78株CRE菌株感染

21、患者的病史資料回顧性調(diào)查分析結(jié)果顯示,發(fā)現(xiàn)多種抗菌藥物的應(yīng)用以及引流管包括導(dǎo)尿管和腦脊液引流管的留置可能是導(dǎo)致CRE菌株感染和難以清除的危險(xiǎn)因素;CRE菌株攜帶或感染患者在不同床位和病房之間的頻繁輪流更換可能是導(dǎo)致CRE菌株在醫(yī)院范圍內(nèi)廣泛播散的關(guān)鍵因素。
　　通過上述研究,得出以下結(jié)論:
　　1.藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,自華山醫(yī)院分離的腸桿菌科細(xì)菌,包括肺炎克雷伯菌、弗勞地檸檬酸桿菌等菌株對(duì)亞胺培南、美羅培南和厄他培南的耐藥率高

22、。其中CRE菌株絕大多數(shù)為對(duì)碳青霉烯類抗生素高度耐藥株。亞胺培南、美羅培南和厄他培南對(duì)其的的MIC90均≥256mg/L。這些CRE菌株絕大多數(shù)分離于神經(jīng)外科病房患者,并以尿液標(biāo)本與呼吸道標(biāo)本的分離株為主。
　　2.改良Hodge試驗(yàn)對(duì)78株CRE菌株中的碳青霉烯酶檢測(cè)的結(jié)果顯示,93.6％(73/78)的菌株為碳青霉烯酶產(chǎn)生株。與PCR法檢測(cè)碳青霉烯酶基因結(jié)果相比,其檢測(cè)靈敏度和特異性分別為97.9％、12.9％。
　　3

23、.PCR檢測(cè)耐藥基因結(jié)果及SDS-PAGE電泳分析外膜孔蛋白結(jié)果顯示,60.3％(47/78)的菌株產(chǎn)碳青霉烯酶,其中33.3％(26/78)產(chǎn)KPC-2型酶。產(chǎn)生碳青霉烯酶是CRE菌株對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機(jī)制之一。35.9％(28/78)的菌株至少丟失1條外膜孔蛋白,提示產(chǎn)生ESBLs和/或質(zhì)粒AmpC酶且同時(shí)合并外膜孔蛋白丟失是導(dǎo)致CRE菌株對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的另一個(gè)重要的耐藥機(jī)制。
　　4.雖經(jīng)多次接合試驗(yàn)和轉(zhuǎn)化

24、試驗(yàn),但編碼KPC-2型碳青霉烯酶的基因始終無法從供體菌轉(zhuǎn)移至敏感菌中,但供體菌中的ESBLs基因卻在接合的過程中進(jìn)行了轉(zhuǎn)移。推測(cè)編碼KPC-2型碳青霉烯酶的基因可能位于染色體上,或與ESBLs基因分別存在于不同的耐藥質(zhì)粒上。
　　5.PFGE同源性分析結(jié)果顯示,碳青霉烯類抗生素耐藥的弗勞地檸檬酸桿菌和肺炎克雷伯菌均存在克隆菌株在不同病房之問的流行和傳播。
　　6.含1片厄他培南(10μg)紙片的5毫升MH肉湯增菌法可提高從

25、各類標(biāo)本中篩選碳青霉烯類抗生素耐藥菌株的檢測(cè)率,可作為醫(yī)院感染調(diào)查的推薦檢測(cè)方法。
　　7.流行病學(xué)調(diào)查研究結(jié)果顯示,神經(jīng)外科病房多數(shù)氧氣濕化瓶中均檢測(cè)到碳青霉烯類抗生素耐藥的菌株,包括肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和嗜麥芽窄食單胞菌等。病床周圍、醫(yī)護(hù)人員手部以及患者肛周均攜帶有CRE菌株。上述因素可能是導(dǎo)致CRE菌株在醫(yī)院環(huán)境廣泛播散引起各種感染尤其是呼吸道感染的關(guān)鍵傳播源頭。
　　8.本研究調(diào)查初步結(jié)果顯示,手衛(wèi)生和加強(qiáng)醫(yī)院