缺氧心肌細(xì)胞微管破壞對線粒體通透性轉(zhuǎn)換的影響及其機制研究.pdf

1、細(xì)胞缺氧是嚴(yán)重?zé)齻畛Ｒ姷牟±砩憩F(xiàn)象之一。嚴(yán)重?zé)齻缙诩创嬖谄髻|(zhì)性心肌損害，即“休克心”。缺血缺氧與炎癥反應(yīng)失控是“休克心”發(fā)生的主要致病因素。線粒體是心肌細(xì)胞缺氧損害的核心靶細(xì)胞器，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)的開放引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換(MPT)，導(dǎo)致線粒體基質(zhì)膨脹、外膜破裂，凋亡信號分子從內(nèi)外膜間釋放，啟動細(xì)胞的壞死和凋亡，故mPTP的開放導(dǎo)致線粒體的不可逆損傷是缺氧性心肌細(xì)胞損害的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 細(xì)胞骨架除了對線粒體胞內(nèi)定

2、位及分布起一定作用外，還可能參與線粒體呼吸功能的調(diào)節(jié)過程。在缺氧條件下，心肌細(xì)胞骨架較早即發(fā)生變化，同時出現(xiàn)線粒體呼吸功能下降。但缺氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞微管破壞是否能導(dǎo)致MPT及其中可能的機制尚不清楚。由于微管的完整性對維持線粒體的結(jié)構(gòu)和功能可能具有重要作用，我們推測，在缺氧條件下，微管變化可能會進(jìn)一步影響線粒體功能，導(dǎo)致MPT的發(fā)生，這可能是缺氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞線粒體功能障礙的重要環(huán)節(jié)。本研究旨在驗證上述設(shè)想，明確缺氧對離體培養(yǎng)的心肌細(xì)胞微管

3、的損傷效應(yīng)，探討缺氧引起的細(xì)胞微管破壞能否導(dǎo)致mPTP開放及微管破壞導(dǎo)致其開放可能的機制。 一、研究目的： 探討缺氧引起的心肌細(xì)胞微管破壞能否導(dǎo)致mPTP開放及微管破壞導(dǎo)致其開放可能的機制。 二、材料方法： 1.將分離培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞在94％N2，5％CO2，1％O2的混合氣體中培養(yǎng)，制作缺氧模型。 2.將心肌細(xì)胞隨機分為對照組(常氧組、A組)、缺氧組(B組)、常氧+微管解聚劑組(colchic

4、ine，C組)、缺氧+微管穩(wěn)定劑組(taxol，D組)。 3.利用免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察A組、B組、C組、D組細(xì)胞0.5h、1h、3h、6h、12h聚合態(tài)微管形態(tài)，Westernblot法檢測各組心肌細(xì)胞聚合態(tài)微管蛋白含量變化。 4.用酯化鈣黃綠素和氯化鈷共孵育的方法檢測mPTP開放，利用四甲基羅丹明乙酯(TMRE)檢測線粒體內(nèi)膜電位，使用免疫印記法檢測胞漿中細(xì)胞色素C含量變化，運用MTT法測定細(xì)胞活性。 5.以熒

5、光探針Fluo-3/F-127檢測細(xì)胞中游離鈣離子濃度，用熒光探針DCFH-DA檢測細(xì)胞中活性氧自由基(ROS)水平。 三、主要結(jié)果 1.正常心肌細(xì)胞微管圍繞核周呈放射狀排列，微管管狀結(jié)構(gòu)非常清晰。缺氧0.5h后，細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)即遭受破壞，表現(xiàn)為免疫熒光強度減弱，微管結(jié)構(gòu)的連續(xù)性開始喪失，變得粗糙且不光滑，微管結(jié)構(gòu)不清晰。缺氧1h后微管破壞程度進(jìn)一步加重，且隨著處理時間的延長，其聚合態(tài)微管蛋白免疫熒光強度和微管蛋白含量與對

6、照組的比值不斷降低，表明隨著處理時間的延長，細(xì)胞微管破壞程度不斷加重。 2.用免疫細(xì)胞化學(xué)方法，通過圖象分析軟件統(tǒng)計分析，量化聚合態(tài)微管免疫熒光強度變化。通過此方法比較4μM、8μM、10μM三種濃度微管解聚劑秋水仙堿(colchicine)和缺氧對心肌細(xì)胞微管的破壞效應(yīng)，初步篩選出8μMcolchicine對心肌細(xì)胞微管的破壞效應(yīng)與缺氧最為接近；Westernblot結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者微管破壞程度和規(guī)律較為類似。此外，實驗結(jié)果顯示，

7、10μM微管穩(wěn)定劑紫杉醇(taxol)可有效地減輕缺氧對心肌細(xì)胞微管的損傷作用。 3.缺氧組和常氧+微管解聚劑組心肌細(xì)胞處理0.5h后，即檢測到mPTP明顯開放，線粒體內(nèi)膜電位損耗和細(xì)胞活性顯著下降，處理1h后，以上變化程度加重，且隨著處理時間的延長，以上現(xiàn)象愈發(fā)顯著。而同一時相點缺氧+微管穩(wěn)定劑組心肌細(xì)胞mPTP開放、線粒體內(nèi)膜電位損耗和細(xì)胞活性下降均明顯輕于缺氧組。 4.在常氧組細(xì)胞胞漿只能檢測到微量的細(xì)胞色素C。缺

8、氧組及常氧+微管解聚劑組處理后0.5h，在細(xì)胞胞漿中檢測到的細(xì)胞色素C明顯增多，且隨著處理時間的延長，胞漿中的細(xì)胞色素C不斷增加；而同一時相點缺氧+微管穩(wěn)定劑組細(xì)胞胞漿中檢測到的細(xì)胞色素C明顯少于缺氧組。 5.缺氧組和常氧+微管解聚劑組處理0.5h后，心肌細(xì)胞中鈣離子濃度及ROS水平較對照組顯著升高。處理1h后，以上變化程度加重，且隨著處理時間的延長，以上現(xiàn)象愈發(fā)顯著。而同一時相點缺氧+微管穩(wěn)定劑組鈣離子濃度及ROS水平升高程度

9、均明顯輕于缺氧組。雖然缺氧組和常氧+微管解聚劑組細(xì)胞鈣離子濃度及ROS水平均較對照組顯著升高，但常氧+微管解聚劑組的鈣離子濃度及ROS水平升高程度顯著低于缺氧組。 四、討論與結(jié)論 1.缺氧對心肌細(xì)胞聚合態(tài)微管的破壞是細(xì)胞缺氧損傷的早期、關(guān)鍵事件，且這種損傷隨著缺氧時間的延長不斷加重，具有時間依賴性。8μM微管解聚劑colchicine對心肌細(xì)胞微管的破壞作用和同一時相點缺氧對微管的破壞效應(yīng)類似。但兩組細(xì)胞被破壞后的微管結(jié)

10、構(gòu)明顯不同，故兩者導(dǎo)致微管結(jié)構(gòu)破壞的機制很可能是不同的。10μM微管穩(wěn)定劑taxol可以有效地減輕缺氧對心肌細(xì)胞微管的損傷作用。 2.缺氧導(dǎo)致微管破壞是引起mPTP開放的重要因素。利用colchicine單純破壞微管可以導(dǎo)致mPTP開放，且taxol能通過減輕微管的缺氧性損害阻止mPTP開放。 3.缺氧心肌細(xì)胞微管破壞引起MPT的可能機制是：①鈣超載；②ROS顯著增加；③微管結(jié)構(gòu)破壞引起VDAC通導(dǎo)性變化導(dǎo)致MPT。

11、 4.雖然colchicine與缺氧導(dǎo)致mPTP開放的效應(yīng)無顯著差別，但缺氧導(dǎo)致的細(xì)胞鈣超載和ROS增加程度要明顯大于colchicine。這可能和兩者破壞微管的機制不同有關(guān)。其具體機制有待進(jìn)一步研究。 5.Taxol能通過穩(wěn)定微管阻止mPTP開放，減輕心肌細(xì)胞的缺氧性損傷。這為臨床防治“休克心”提供了新的思路和實驗依據(jù)。 VDAC(voltagedependentanionchannel)即電壓依賴性陰離子通道，也