腺苷A1受體對缺氧心肌細胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放的影響及調(diào)控機制.pdf

1、嚴重燒傷后，在因毛細血管通透性增加導致有效循環(huán)血容量顯著減少之前，即可出現(xiàn)心肌損害及心臟泵血功能減弱，不僅引起心功能不全，還可成為誘發(fā)或加重休克的重要啟動因素之一，由此提出了燒傷早期缺血缺氧損害的“休克心”假說。防治燒傷后“休克心”對減輕嚴重燒傷早期缺血缺氧損害具有重要臨床意義，但目前尚缺乏有效措施。我們以往的研究證明，線粒體是心肌細胞缺血缺氧損害的核心靶細胞器，線粒體的受損，特別是其通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)的開放引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換(

2、MPT)，可激活線粒體依賴的凋亡途徑，是導致細胞凋亡和壞死的重要環(huán)節(jié)。 腺苷是體內(nèi)重要的內(nèi)源性活性物質(zhì)，其A1受體在缺氧心肌細胞的保護作用一直受到關(guān)注。上調(diào)腺苷A1受體的表達或使用腺苷A1受體激動劑預處理后，心肌細胞耐受缺氧的能力明顯增強，其凋亡和壞死的數(shù)量顯著降低。既往研究腺苷A1受體的缺氧保護作用主要集中在蛋白激酶C(PKC)和線粒體膜上ATP敏感的鉀通道(mitoKATP)上，但腺苷A1受體活化后能否影響缺氧心肌細胞MPT

3、P的開放及其可能的機制尚不清楚。由于MPTP的開放在調(diào)控缺氧細胞凋亡和壞死的過程中起著重要作用，我們設想，腺苷A1受體可能激活PKC、mitoKATP途徑，通過影響MPTP的開放從而減少細胞的凋亡和壞死。本研究旨在對此假設進行驗證。 一、研究目的 探討腺苷A1受體活化能否減少缺氧心肌細胞MPTP的開放及其可能的調(diào)控機制。 二、材料方法 1．將分離培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞在94％N<,2>，5％CO<,2>，1％

4、O<,2>的混合氣體中培養(yǎng)，制作缺氧模型。 2．將心肌細胞分為正常組(常氧組，A組)、缺氧組(B組)、缺氧+腺苷Al受體激動劑(CCPA)組(c組)、缺氧+腺苷Al受體激動劑(CCPA)+mitoKATP阻斷劑(5-HI)組(D組)和缺氧+腺苷Al受體激動劑(CCPA)+PKC阻斷劑(CHE)組(E組)。 3．缺氧6小時后，用酯化鈣黃綠素(Calcein-AM)和氯化鈷(CoCl<,2>)共孵育的方法檢測MPTP開放(激

5、光共聚焦顯微鏡)，利用四甲基羅丹明乙酯(TMRE)檢測線粒體膜電位，用熒光探針DCFH-DA檢測細胞中活性氧自由基(ROS)水平，運用CCK-8法測定細胞活性。 4．用免疫熒光觀察PKC的表達變化，免疫印跡法分別檢測總蛋白、胞漿蛋白、胞膜蛋白中PKC的含量變化。 三、主要結(jié)果 1．正常和缺氧心肌細胞中，PKC表達量少，主要分布在胞漿中。在缺氧+CCPA組和缺氧+CCPA+5-HD組，PKC表達量明顯增多，且以胞膜

6、蛋白中PKC的增多更明顯。 2．缺氧組心肌細胞活力明顯下降，缺氧+CCPA組細胞活力下降明顯輕于缺氧組，PKC阻斷劑CHE和mitoK<,ATP>阻斷劑5-HD均可消除CCPA對缺氧心肌細胞的這種保護作用。 3．正常心肌細胞線粒體綠色熒光強，呈顆粒狀。缺氧組發(fā)生明顯的MPTP開放，表現(xiàn)為熒光強度與正常組相比減弱。腺苷Al受體激動劑(CCPA)能明顯減少MPTP的開放，其熒光強度與正常組相比無明顯差別。而PKC阻斷劑CHE

7、和mitoK<,ATP>阻斷劑5-HD可消除CCPA的保護作用。 4．缺氧組心肌細胞線粒體膜電位與正常組相比明顯降低，細胞內(nèi)ROS則明顯增多。缺氧+CCPA組線粒體膜電位和ROS與正常組無明顯差異，PKC阻斷劑CHE和mitoK<,ATP>阻斷劑5-HD可減弱缺氧條件下CCPA的上述作用。 四、討論與結(jié)論 1．腺苷A1受體激動劑CCPA能使缺氧心肌細胞PKC總表達量增加，且PKC的活化并不依賴于細胞膜上的表達增多

8、，而很可能是通過在細胞器上表達增多而實現(xiàn)的。 2．在心肌細胞CCPA傳導通路中，mitoK<,ATP>阻斷劑并不能阻斷CCPA對PKC的影響，表明信號通路可能是由PKC傳導到mitoK<,ATP>。 3．CCPA能減少缺氧導致的MPTP開放，并可能受PKC-mitoK<,ATP>信號通路調(diào)控。 4．CCPA通過mitoK<,ATP>減少缺氧心肌細胞MPTP開放的機制可能是：①維持線粒體膜電位；②減少ROS的生成。