治療性低溫對(duì)缺氧期心肌細(xì)胞自噬流的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：隨著國民生活方式的改變，我國冠心病的發(fā)病率正逐年攀升并呈年輕化趨勢(shì)。為了探討治療性低溫(TH)在缺血期對(duì)心肌細(xì)胞自噬及自噬流的影響，并探討相關(guān)機(jī)制。
　　方法：使用大鼠心肌細(xì)胞株H9c2，置于含95％氮?dú)獾然旌蠚怏w的缺氧盒模擬缺氧，PBS代替完全培養(yǎng)基模擬缺血。
　　第一部分實(shí)驗(yàn):在不同缺氧時(shí)間中，單純?nèi)毖跖cTH處理后的細(xì)胞狀態(tài)及活性的差異:實(shí)驗(yàn)分組:1）空白對(duì)照組(Control)2)單純?nèi)毖踅M(Hypoxia)3)

2、TH處理缺氧組(TH)，分別置于缺氧盒中模擬缺氧1h、2h、3h，采用光學(xué)顯微鏡評(píng)估細(xì)胞狀態(tài)，臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)判斷活性情況。
　　第二部分實(shí)驗(yàn):進(jìn)一步探討TH組與單純?nèi)毖踅M缺氧1-3 h的自噬水平及3h自噬流表達(dá)水平的差異:實(shí)驗(yàn)分組:1）空白對(duì)照組(Control)2)單純?nèi)毖踅M(Hypoxia)3) TH處理缺氧組(TH)，置于缺氧盒中模擬缺氧1-3 h，免疫印跡法(Western Blot)觀察自噬相關(guān)蛋白自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈3

3、B(LC3B)、p62、Beclin-1，最后用透射電子顯微鏡觀察缺氧3h各組自噬泡形成，腺病毒GFP-mRFP-LC3熒光瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)明確自噬流表達(dá)水平。
　　通過藥物干預(yù)自噬水平，觀察TH在缺氧心肌細(xì)胞中的作用，實(shí)驗(yàn)分組:1）單純?nèi)毖踅M(Hypoxia)2)TH處理缺氧組(Hypoxia+TH)3)3甲基腺嘌呤干預(yù)單純?nèi)毖踅M（Hypoxia+3-MA）4)3甲基腺嘌呤干預(yù)TH處理缺氧組(Hypoxia+ TH+3-MA)5）雷

4、帕霉素干預(yù)單純?nèi)毖踅M（Hypoxia+rapamycin）6）雷帕霉素干預(yù)TH處理缺氧組(Hypoxia+TH+rapamycin)，3 MA(10 mM)、雷帕霉素(0.1μ M)相關(guān)組造模前2h給藥，同時(shí)放入缺氧盒中模擬缺氧，免疫印跡法(Western Blot)檢測自噬相關(guān)蛋白LC3B，p62的表達(dá)情況，臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活性。
　　第三部分實(shí)驗(yàn):進(jìn)一步應(yīng)用雷帕霉素預(yù)處理觀察缺氧期TH影響自噬表達(dá)水平中在mTOR信號(hào)通路

5、的相關(guān)機(jī)制，實(shí)驗(yàn)分組:1）單純?nèi)毖踅M(Hypoxia)2)TH處理缺氧組(TH)3)雷帕霉素干預(yù)單純?nèi)毖踅M(Hypoxia+rapamycin)4)雷帕霉素干預(yù)TH處理缺氧組(TH+rapamycin)，雷帕霉素(0.1μ M)相關(guān)組造模前2小時(shí)給藥，同時(shí)放入缺氧盒中模擬缺氧，免疫印跡法(Western Blot)檢測自噬相關(guān)蛋白LC3B、p62，以及哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路相關(guān)蛋白磷酸化mTOR、核糖體蛋白S6(S6

6、)的表達(dá)情況。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差別統(tǒng)計(jì)采用單因素方差分析比較，各組均數(shù)間兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。
　　結(jié)果：1、在不同缺氧時(shí)間中，單純?nèi)毖跖cTH處理后細(xì)胞狀態(tài)差異:在光學(xué)顯微鏡下，隨著缺氧時(shí)間的延長，越來越多的細(xì)胞發(fā)生皺縮，變圓，與缺氧組相比，TH處理的細(xì)胞在缺氧3h

7、細(xì)胞形態(tài)明顯改善（圖1-1）;臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，隨著缺氧時(shí)間的延長，細(xì)胞活性明顯下降，而TH能有效減少細(xì)胞死亡(圖1-2)。
　　2、進(jìn)一步探討TH組與單純?nèi)毖踅M缺氧3h后自噬活性和自噬流表達(dá)水平的差異:缺氧刺激后，免疫印跡法(Western Blot)檢測自噬相關(guān)蛋白，顯示隨著缺氧時(shí)間延長（缺血1、2、3 h），單純?nèi)毖踅M與對(duì)照組相比LC-3B表達(dá)顯著增高(p＜0.01)（圖2-1.B），p62表達(dá)也相應(yīng)顯著降低(p＜0

8、.01)（圖2-1.C）;其中缺氧處理2h和3h的時(shí)候，而單純?nèi)毖踅M與TH處理組相比LC-3B表達(dá)顯著增高（2小時(shí)p＜0.05，3小時(shí)p＜0.01)，p62表達(dá)也相應(yīng)顯著降低(p＜0.01);但Beclin-1的表達(dá)水平在缺氧3h處理后單純?nèi)毖踅M與對(duì)照組相比顯著增高(p＜0.01)，但單純?nèi)毖踅M和TH處理組之間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2-1，D)。
　　為了明確在缺氧3h時(shí)TH對(duì)自噬小體形成以及自噬流的影響，應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察，對(duì)照

9、組、單純?nèi)毖踅M、TH組中自噬小體分別是:2.33±1.53（個(gè)/HPF），7.00±1.00（個(gè)/HPF），3.67±1.15（個(gè)/HPF），統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明單純?nèi)毖踅M明顯高于對(duì)照組(p＜0.01)，也明顯高于TH組(p＜0.05)，TH組與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖2-2）。表明缺氧損傷能大量促進(jìn)自噬小體形成，TH能部分減少缺氧損傷后的自噬小體。自噬流，即自噬小體的產(chǎn)生與消逝的動(dòng)態(tài)過程，被認(rèn)為是更為科學(xué)地評(píng)價(jià)自噬水平的方式，我們進(jìn)一步探討TH

10、在缺氧下對(duì)自噬流調(diào)控情況。我們應(yīng)用腺病毒GFP-mRFP-LC3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀察到缺氧3h后，對(duì)照組、單純?nèi)毖踅M、TH組中的GFP（點(diǎn)/單個(gè)細(xì)胞）分別是:4.33±2.52，63.00±9.17，31.00±11.14; mRFP（點(diǎn)/單個(gè)細(xì)胞）分別是8.33±5.13，139.00±14.11，43.67±18.93。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明在GFP和mRFP中單純?nèi)毖踅M均明顯高于對(duì)照組和TH組(p＜0.01)，TH組與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即黃

11、點(diǎn)(GFP與mRFP融合的部分)中單純?nèi)毖踅M均明顯高于對(duì)照組和TH組(p＜0.01)，TH組與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖2-3）。上述結(jié)果表明，缺氧能顯著促進(jìn)自噬流，而TH處理能減少缺氧引起的自噬小體以及自噬溶酶體的形成，從而抑制自噬流。
　　通過藥物干預(yù)自噬活性水平，驗(yàn)證TH在缺氧心肌細(xì)胞中的作用及相關(guān)機(jī)制。
　　3、雷帕霉素預(yù)處理觀察缺氧期TH影響自噬表達(dá)水平中在mTOR信號(hào)通路的相關(guān)機(jī)制:mTOR被認(rèn)為是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中負(fù)

12、向調(diào)控自噬的關(guān)鍵蛋白。核糖體蛋白S6(S6)是mTOR下游的效應(yīng)蛋白，磷酸化S6被認(rèn)為是mTOR激活程度重要標(biāo)記蛋白。因此，我們檢測了各組mTOR和S6的磷酸化程度。缺氧刺激后，應(yīng)用免疫印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白，單純?nèi)毖踅M與對(duì)照組相比磷酸化mTOR、S6的顯著減少(p＜0.01);而TH處理組與單純?nèi)毖踅M相比磷酸化mTOR和S6蛋白表達(dá)顯著增多(p＜0.01)，表明TH處理能部分恢復(fù)缺氧后被抑制的mTOR通路相關(guān)蛋白中的磷酸化mTOR、S

13、6。雷帕霉素是自噬激動(dòng)劑，同時(shí)也是mTOR蛋白的抑制劑，為了驗(yàn)證mTOR通路在TH干預(yù)缺氧引起的自噬過程中的作用，我們應(yīng)用雷帕霉素預(yù)處理2h，western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白，雷帕霉素預(yù)處理后的兩組與雷帕霉素未處理的兩組（即3組與1組相比;4組與2組相比）相比顯示LC-3B表達(dá)增高(p＜0.05)，p62表達(dá)也相應(yīng)顯著降低(p＜0.01)，表明雷帕霉素能有效上調(diào)兩組的自噬活性水平（圖3-1.B，C）;然而，雷帕霉素?zé)o法進(jìn)一步降

14、低單純?nèi)毖鹾螅?組與3組）的磷酸化mTOR和S6蛋白表達(dá)水平(p＞0.05)，卻可以抑制TH處理后（2組與4組）的磷酸化mTOR和S6蛋白表達(dá)水平(p＜0.05)（圖31.D，E），雷帕霉素處理后的缺氧組與該藥處理后的TH組（3組與4組）相比，磷酸化的mTOR和S6并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)，表明雷帕霉素處理后能充分抑制mTOR下游信號(hào)通路?？偠灾?，雷帕霉素處理后的兩組自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平明顯升高，表明雷帕霉素能促進(jìn)缺氧組和TH組

15、的自噬表達(dá)水平，且mTOR通路下游相關(guān)蛋白表達(dá)減少，表明在缺氧期TH能有效激活mTOR通路，且部分通過mTOR通路下調(diào)自噬水平。
　　結(jié)論：1、本研究通過建立誘導(dǎo)H9c2大鼠心肌細(xì)胞株缺氧損傷模擬心肌缺血，缺氧3h后可明顯造成H9c2心肌細(xì)胞損傷，表明心肌缺氧損傷模型構(gòu)建成功，且TH能有效減輕心肌細(xì)胞缺氧損傷，為進(jìn)一步探討TH對(duì)缺氧心肌的自噬水平的影響及相關(guān)機(jī)制研究提供了研究基礎(chǔ)。
　　2、本研究通過缺氧處理H9c2心肌細(xì)胞

16、模擬心肌缺血損傷，TH處理干預(yù)細(xì)胞損傷，檢測自噬及自噬流水平，表明TH部分抑制缺氧上調(diào)的自噬及自噬流。并進(jìn)一步應(yīng)用自噬抑制劑3-甲基腺苷酸、自噬激動(dòng)劑雷帕霉素預(yù)處理后再缺氧處理H9c2心肌細(xì)胞模擬的心肌缺血損傷，明確TH在缺氧心肌細(xì)胞中的作用:(1)一定水平的自噬對(duì)維持細(xì)胞活性至關(guān)重要;(2)缺氧期間TH保護(hù)心肌細(xì)胞不僅僅通過對(duì)自噬水平的調(diào)節(jié)，還存在其他細(xì)胞保護(hù)機(jī)制。
　　3、本研究通過應(yīng)用自噬激動(dòng)劑雷帕霉素預(yù)處理后再缺氧處理H9