脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞輔助自體脂肪組織游離移植后早期調(diào)控再血管化的機(jī)制.pdf

1、研究背景和目的：
　　 就目前整形美容的發(fā)展來(lái)看，自體脂肪移植已經(jīng)廣泛運(yùn)用于美容整形和修復(fù)創(chuàng)傷導(dǎo)致的軟組織缺損的修復(fù)，其發(fā)展歷史可以追溯到19世紀(jì)。在1911年，Bruning被最先報(bào)道將自體脂肪注射到皮下用于軟組織的填充。隨著抽脂技術(shù)的不斷成熟，自體脂肪組織容易獲取，不在供區(qū)和受區(qū)留下瘢痕，且不產(chǎn)生免疫排除反應(yīng)、不會(huì)引起交叉感染，所以自體脂肪組織可以作為一種理想的軟組織填充劑。
　　 但是自體脂肪移植的臨床應(yīng)用受到移植

2、脂肪存活率的限制，根據(jù)長(zhǎng)時(shí)間的隨訪觀察，移植脂肪最終的存活率為20-80％。在移植的早期，移植脂肪和受區(qū)之間尚未建立血供，脂肪組織只能靠周?chē)M織滲出的組織液提供營(yíng)養(yǎng)，滲出距離僅為100-200μm。此時(shí)移植脂肪處于急性缺氧缺血的狀態(tài)，移植脂肪中央?yún)^(qū)出現(xiàn)大量脂肪的壞死，隨后壞死的脂肪組織被纖維結(jié)締組織取代。由此可見(jiàn)，在自體脂肪移植中，在移植后的早期及時(shí)、充分的血供建立，對(duì)于移植脂肪的存活是非常重要的。目前細(xì)胞療法被應(yīng)用于自體脂肪移植，特別

3、是脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ASCs）輔助自體脂肪游離移植。
　　 Yoshimura等人研究細(xì)胞輔助的脂肪移植，他們將包含有ASCs的血管基質(zhì)片段混合脂肪一起移植，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞輔助移植比對(duì)照組存活率高。本課題組前期的研究也表明，ASCs混合脂肪移植可促進(jìn)再血管化，從而提高移植脂肪的存活率。目前為止，ASCs輔助自體脂肪游離移植，被證實(shí)可以有效的提高移植脂肪的存活率。但是ASCs在脂肪

4、移植中究竟發(fā)揮了怎樣的作用，是通過(guò)什么機(jī)制促進(jìn)游離脂肪的存活，這些問(wèn)題都沒(méi)有明確的答案。本實(shí)驗(yàn)圍繞以下幾個(gè)科學(xué)問(wèn)題展開(kāi):(1) ASCs輔助自體脂肪游離移植，在形態(tài)學(xué)方面移植的早期移植脂肪發(fā)生怎樣的變化？(2) ASCs調(diào)控移植脂肪再血管化的主要機(jī)制？
　　 本實(shí)驗(yàn)首先針對(duì)單純自體脂肪移植和ASCs輔助自體脂肪移植后早期不同時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)檢測(cè)移植脂肪的存活率和HE染色切片，對(duì)移植脂肪組織學(xué)的變化進(jìn)行比較研究，再應(yīng)用ELISA等技術(shù)

5、來(lái)探討ASCs調(diào)控移植脂肪再血管化、提高移植脂肪存活率的主要機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、ASCs的分離和培養(yǎng)
　　 將抽脂所得的脂肪用PBS反復(fù)沖洗3次，再用0.125％Ⅰ型膠原酶于37℃水浴消化30min，期間反復(fù)震蕩3次。用與膠原酶消化后的混懸液等體積的完全培養(yǎng)液（高糖DMEM+10％胎牛血清+1％雙抗）終止消化，200目濾網(wǎng)過(guò)濾，1200g離心5min以去除懸浮的脂肪細(xì)胞、脂滴等，去上清。將細(xì)胞沉淀用1

6、ml的完全培養(yǎng)液重懸后，加入6倍體積的紅細(xì)胞裂解液，混勻后室溫下孵育6min，1200g/min離心5min，去上清，再以適量完全培養(yǎng)基重懸沉淀，接種于培養(yǎng)皿，再加入適量完全培養(yǎng)液，置于37℃、5％ CO2孵箱培養(yǎng)。細(xì)胞每3天換一次培養(yǎng)，每周以1∶3的比例傳代。本實(shí)驗(yàn)用的ASCs均為第三代細(xì)胞。
　　 2、單純自體脂肪游離移植和ASCs輔助自體脂肪游離移植的模型制備及移植脂肪存活的評(píng)價(jià)
　　 將24只裸鼠背部左、右側(cè)隨機(jī)

7、分為A、B組(n=36)，采用Coleman技術(shù)分別于A、B組裸鼠背部皮下移植含5×105個(gè)ASCs的脂肪0.5 mL和脂肪0.5mL。移植后1、5、7、14、30、90d分別取6只裸鼠，取出移植脂肪組織，進(jìn)行以下觀測(cè):(1)移植脂肪的大體觀察;(2)移植脂肪的體積及存活率;(3) HE染色切片。
　　 3、ASCs調(diào)控移植脂肪再血管化的檢測(cè)
　　 將各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的兩組移植脂肪進(jìn)行一下指標(biāo)的檢測(cè):(1)ELISA檢測(cè)VEG

8、F(vascular endothelial growth factor，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)和HGF(hepatocyte growthfactor，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子)的表達(dá);(2)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。兩組之間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn);組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的差異采用方差分析;完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的多樣本均數(shù)比較采用LSD檢驗(yàn)。
　　

9、 結(jié)果：
　　 1.移植后早期不同時(shí)間點(diǎn)兩組移植脂肪存活率:A組:1天(63.67±4.97)％，4天（67.33±7.66）％，7天(74.67±4.13)％，14天(79.67±8.73)％，30天（64.33±7.53）％，90天（55.00±6.78）％;B組:1天(61.33±1.63)％，4天(65.00±4.86)％,7天(74.33±4.97)％，14天(80.17±8.64)％,30天（54.67±7.55）

10、％，90天(42.67±6.77)％。移植后早期不同時(shí)間點(diǎn)兩組采用配對(duì)t檢驗(yàn)比較，在1-14天兩組移植脂肪存活率沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)，在30天和90天A組存活率明顯高于B組(P=0.001，P=0.006)移植后隨著時(shí)間的變化兩組均采用方差分析，發(fā)現(xiàn)1-14天兩組移植脂肪存活率稍有增高的趨勢(shì)，隨后開(kāi)始明顯的下降(P＜0.05)。
　　 2.移植后早期不同時(shí)間點(diǎn)兩組移植脂肪組織學(xué)的變化:移植后一周內(nèi)，兩組移植脂肪組織中央

11、區(qū)可見(jiàn)少量的空泡、囊腔樣改變，脂肪細(xì)胞的數(shù)量和大小無(wú)明顯變化。移植后兩周，移植脂肪組織中央?yún)^(qū)可見(jiàn)更多的壞死脂肪細(xì)胞，融合成空泡，且脂肪細(xì)胞大小不一。脂肪細(xì)胞間距逐漸變寬，且有大量的有核細(xì)胞的浸潤(rùn)，此現(xiàn)象在移植后第14天最為明顯。在移植后第4天，A組在移植脂肪的表面可見(jiàn)到有血管從移植脂肪組織的包膜長(zhǎng)入，但這個(gè)現(xiàn)象B組在移植后第7天才出現(xiàn)。隨著時(shí)間推移，移植物血管的數(shù)量逐漸增加，且血管向移植脂肪組織中央?yún)^(qū)生長(zhǎng)，但A組血管數(shù)量明顯多于B組。在

12、移植后30天，兩組移植脂肪中均出現(xiàn)不同程度的纖維化，B組較A組更為嚴(yán)重。
　　 3.①ELISA檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)VEGF表達(dá):A組在移植后第4天，VEGF的表達(dá)達(dá)到高峰，并一直持續(xù)到第14天，隨后開(kāi)始下降;B組VEGF高峰出現(xiàn)的時(shí)間較A組晚，于第7天出現(xiàn)，隨后逐漸下降。②ELISA檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)HGF表達(dá):HGF的高表達(dá)在A、B組均出現(xiàn)在第7天，并維持到第14天，隨后逐漸下降，A組表達(dá)量始終高于B組。
　　 討論：

13、　　 先天性或后天獲得性軟組織缺損的修復(fù)，是整形外科面臨的非常重要的課題之一，目前被廣泛應(yīng)用的方法有人工合成材料的填充植入、真皮脂肪瓣的游離移植等。但以上方法均存在不同的缺點(diǎn)，如供區(qū)損傷、組織壞死、排斥反應(yīng)、材料吸收等。自體脂肪組織移植具有易獲取、無(wú)免疫排斥反應(yīng)、供受區(qū)損傷小等特點(diǎn)，因此自體脂肪組織成為理想的軟組織填充劑。然而，對(duì)于自體脂肪組織移植的遠(yuǎn)期的吸收率的報(bào)道尚不一致(20-80％)，限制其在臨床的廣泛應(yīng)用。
　　 因

14、此，自體脂肪游離移植后，早期充分的血管建立對(duì)于保證移植脂肪組織高的存活率十分重要。移植后2周內(nèi)兩組移植脂肪組織存活率有增加，我們考慮是這時(shí)期大量的脂肪細(xì)胞壞死，釋放出脂滴，組織水腫，大量有核細(xì)胞浸潤(rùn)，這些組織學(xué)上的變化會(huì)導(dǎo)致移植后早期脂肪組織體積的增加。在移植后的早期兩組移植脂肪組織在大體觀察及存活率上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這說(shuō)明在自體脂肪游離移植后的早期，移植脂肪組織的變化主要是發(fā)生于組織結(jié)構(gòu)而不是存活率。
　　 關(guān)于移植脂肪組織最終

15、的轉(zhuǎn)歸，存在兩種理論:一種是“宿主取代論”，另一種是“細(xì)胞存活論”?！八拗魅〈摗敝傅氖撬拗鞯慕M織細(xì)胞（可能是巨噬細(xì)胞）浸潤(rùn)，吞噬壞死脂肪細(xì)胞釋放出的脂質(zhì)，最終取代移植脂肪中的脂肪細(xì)胞?！凹?xì)胞存活論”指的是脂肪移植后，移植脂肪組織中部分存活的細(xì)胞，長(zhǎng)期存活。后一種理論被廣泛接受。因此，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為移植脂肪組織中存活脂肪細(xì)胞的數(shù)量與最終存活脂肪的體積相關(guān)，所以在純化和最大化存活脂肪細(xì)胞的數(shù)目上做出了很多的努力。有研究指出，在距離移植脂肪

16、組織邊緣300微米以內(nèi)的細(xì)胞（包括脂肪細(xì)胞和ASCs）基本均可以存活，這個(gè)區(qū)域稱之為“存活區(qū)”。向內(nèi)靠近的第二區(qū)域?yàn)椤霸偕鷧^(qū)域”，此區(qū)域組織的存活依賴于再血管化的程度以及與周?chē)M織接觸的情況。在這個(gè)區(qū)域內(nèi)的脂肪細(xì)胞在移植后的第1天就死亡，但是ASCs可以存活下來(lái)分化為新的脂肪細(xì)胞代替死亡的脂肪細(xì)胞。最核心的區(qū)域?yàn)椤皦乃绤^(qū)域”，這個(gè)區(qū)域的脂肪細(xì)胞和ASCs均死亡，無(wú)脂肪再生的發(fā)生，壞死脂肪液化被吸收，由纖維結(jié)締組織填充或形成鈣化。

17、　　 研究表明在游離脂肪移植后的第4天，就可以觀察到從宿主血管出現(xiàn)血管新生長(zhǎng)入移植脂肪組織。這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，而且在移植后的2周內(nèi)，相對(duì)于單純脂肪移植組，ASCs輔助脂肪移植組的組織學(xué)觀察顯示出移植脂肪組織中更高的血管密度。我們還發(fā)現(xiàn)在移植脂肪組織中，新生血管越密集的區(qū)域，就有越多的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。這個(gè)現(xiàn)象可能與巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)存在相關(guān)關(guān)系，可能促進(jìn)血管生成。另外有研究表明，在腫瘤組織中當(dāng)巨噬細(xì)胞暴露在缺氧的環(huán)境下，巨噬細(xì)胞的表型

18、可發(fā)生變化，并激活多種促增殖和血管生成細(xì)胞因子和酶的表達(dá)。
　　 兩組移植脂肪組織存活率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是在組織學(xué)上ASCs輔助脂肪移植組表現(xiàn)出更好的血管化，這可能跟ASCs的旁分泌機(jī)制相關(guān)。脂肪抽吸和注射的過(guò)程會(huì)對(duì)脂肪組織造成機(jī)械性的損傷，并且移植過(guò)程中以及移植后的缺血缺氧也會(huì)對(duì)脂肪組織造成損傷。在面對(duì)這樣機(jī)械性損傷，或者缺血缺氧的環(huán)境中，ASCs可分泌多種促血管生成生長(zhǎng)因子如VEGF、HGF以及bFGF等。在缺氧的環(huán)境下(2

19、％O2)，ASCs的細(xì)胞增殖能力和分泌促血管生成生長(zhǎng)因子(如VEGF、bFGF)的能力都顯著提高。還有其他的研究也得出相似的結(jié)論，在缺血缺氧的環(huán)境中，促血管生成生長(zhǎng)因子mRNA的表達(dá)增加了1.7-4.1倍。在Wistar大鼠的游離脂肪移植模型中，VEGF在間質(zhì)單核細(xì)胞中的表達(dá)在移植后7天出現(xiàn)最高峰，隨后逐漸下降。這與我們的研究結(jié)果相符合，ASCs輔助脂肪移植時(shí)ASCs可促進(jìn)VEGF的分泌高峰提前到移植后第4天。在人脂肪組織受到機(jī)械性損傷

20、后，在創(chuàng)傷愈合的早期，首先釋放的是FGF-2、TGF-β以及PDGF等，在這些生長(zhǎng)因子的表達(dá)量開(kāi)始下降后，在損傷后的1周VEGF和HGF的分泌才逐漸增高。在損傷或者缺血缺氧的環(huán)境中，受損傷的組織釋放出大量的FGF-2，F(xiàn)GF-2通過(guò)JNK信號(hào)通路刺激ASCs的增殖和分泌HGF。因此在我們的研究中，ASCs輔助脂肪移植組中HGF在移植后一直維持一個(gè)較高的分泌水平，可能是因?yàn)槌渥愕耐庠葱缘腁SCs在缺血缺氧的環(huán)境中釋放大量的HGF，使得HG

21、F在移植后的早期就維持在一個(gè)較高分泌水平。而單純脂肪移植組HGF的分泌增多在移植后第14天，我們考慮可能是因?yàn)橐浦埠笫軗p傷的受區(qū)組織和脂肪組織先釋放FGF-2，F(xiàn)GF-2再調(diào)控HGF分泌，使HGF的釋放在移植一周后才開(kāi)始增多。有研究證實(shí)，在體外缺血缺氧的條件下ASCs只能存活3天。在脂肪移植后的1周內(nèi)大部分的ASCs會(huì)因?yàn)槿毖毖醵鴫乃馈Ｒ虼?，ASCs通過(guò)旁分泌機(jī)制促血管生成的作用主要是發(fā)生在脂肪移植后2周內(nèi)。
　　 結(jié)論：

22、r>　　 1.在移植后的早期（2周內(nèi)），單純自體脂肪游離移植和ASCs輔助自體脂肪游離移植，兩組移植脂肪組織學(xué)結(jié)構(gòu)的差異并未在大體觀和存活率上體現(xiàn)出來(lái)，移植后炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和組織水腫導(dǎo)致移植脂肪的體積增加。
　　 2.ASCs輔助脂肪移植較單純脂肪移植呈現(xiàn)出更好的再血管化，雖然在脂肪后的早期對(duì)移植脂肪的存活率并沒(méi)有影響，但是對(duì)移植后30天移植脂肪的存活率產(chǎn)生明顯影響。
　　 3.ASCs輔助脂肪移植的再血管化較單純脂肪移