重組irisin促進白色脂肪組織向棕色脂肪組織轉變及機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分進行論述：
　　第一部分 Irisin通過P38 MAPK，ERK途徑促進小鼠白色脂肪向棕色脂肪轉變
　　目的:
　　在畢赤酵母中建立高效的重組irisin表達體系，在體外研究重組irisin在脂肪細胞棕色化過程中的作用，并闡明其分子機制;體內研究重組irisin對高脂飼養(yǎng)的肥胖小鼠的作用。
　　方法:
　　1.人重組irisin蛋白的表達與純化。
　　2.點突變irisin cD

2、NA以確定重組irisin糖基化位點。
　　3.培養(yǎng)大鼠原代脂肪細胞。
　　4.3T3L1脂肪前體細胞分化為成熟脂肪細胞。
　　5.重組irisin與脂肪細胞膜結合試驗。
　　6.RNA提取及qRT-PCR檢測相關基因的表達。
　　7.細胞免疫熒光染色(ICC)檢測irisin處理后成熟3T3L1細胞內UCP1的表達。
　　8.Western blot檢測irisin處理后原代大鼠脂肪細胞及成熟3T3

3、L1細胞后，UCP1水平和信號通路蛋白的活化情況。
　　9.動物實驗觀察重組irisin對高脂喂養(yǎng)的肥胖小鼠白色脂肪棕色化、體重和糖耐量的影響。
　　10統(tǒng)計學分析:本研究全部實驗重復3次及3次以上，結果使用單因素方差分析或Student's t檢驗。P＜0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1.重組irisin表達和純化以及其糖基化:
　　(1)畢赤酵母可表達高濃度重組irisin。
　

4、　(2)考馬斯蘭染色顯示重組irisin具有分子量為15,22和25的三條帶。
　　(3)PNGase F去糖基化酶處理后，分子量為25和22的兩條帶消失。
　　(4)突變第7位和第52位天冬酰胺后，分子量為25的條帶消失。
　　2.重組irisin可以促進大鼠原代脂肪細胞和成熟3T3L1細胞棕色化:
　　(1)實時定量PCR和Western blot結果顯示重組irisin處理大鼠原代脂肪細胞4天后， UCP1

5、基因和蛋白水平明顯增高，且呈濃度依賴性。
　　(2)實時定量PCR顯示irisin處理分化的3T3L1細胞4天后，諸多棕色脂肪標志物基因水平明顯增高。
　　(3)Western blot和ICC結果顯示，irisin處理后，成熟3T3L1細胞內UCP1水平明顯增高。
　　(4)實時定量PCR和Westernblot結果顯示突變重組irisin的兩個糖基化位點后，其棕色化功能較未突變者降低。
　　3.ERK和p38

6、 MAPK信號傳導通路參與Irisin誘導的白色脂肪組織棕色化:
　　(1)Western blot結果顯示，Irisin處理原代大鼠脂肪細胞和成熟3T3L1細胞5,10，20，30分鐘后，兩種脂肪細胞的磷酸化ERK和p38MAPK蛋白表達水平明顯升高。
　　(2)用ERK抑制劑U0126和p38抑制劑SB203580分別抑制irisin誘導的ERK和p38磷酸化后，實時定量PCR和Western blot實驗結果顯示，兩種

7、抑制劑均明顯降低irisin所致的UCP1增加。
　　4.免疫熒光結果顯示irisin可以結合在成熟3T3L1細胞的胞膜上。
　　5.重組irisin可以調節(jié)高脂飼養(yǎng)的肥胖小鼠體重及葡萄糖穩(wěn)態(tài):
　　(1)向高脂喂養(yǎng)的肥胖小鼠腹腔注射重組irisin14天，諸多棕色脂肪標志基因明顯增高。
　　(2)免疫組化結果顯示腹腔注射重組irisin后，UCP1表達明顯增高。
　　(3)注射重組irisin后，肥胖小鼠

8、體重降低。
　　(4)腹腔注射葡萄糖耐量試驗(IGPTT)結果顯示，注射irisin后，小鼠糖耐量得到明顯改善。
　　(5)注射重組irisin后，肥胖小鼠空腹胰島素水平降低。
　　結論:
　　1.畢赤酵母可以高濃度表達重組irisin蛋白，且重組irisin蛋白具有兩個糖基化位點。
　　2.重組Irisin可以促進大鼠原代脂肪細胞和成熟3T3L1脂肪細胞轉變?yōu)樽厣炯毎?br>　　3.Irisin的棕

9、色化功能是通過活化ERK MAPK和p38MAPK信號傳導通路實現(xiàn)的。
　　4.脂肪細胞膜上或許有irisin受體存在。
　　5.重組Iris in可以降低高脂喂養(yǎng)的肥胖小鼠體重并改善其葡萄糖穩(wěn)態(tài)。
　　第二部分 Irisin對人原代皮下脂肪的棕色化作用
　　目的:
　　研究Irisin對人皮下白色脂肪組織(scWAT)影響及其作用機制。
　　方法:
　　1.重組irisin蛋白的制備。

10、　　2.人scWAT的獲取
　　3.人原代脂肪細胞的分離及培養(yǎng)。
　　4.人原代脂肪前體細胞向成熟脂肪細胞分化。
　　5.新鮮脂肪組織塊的培養(yǎng)及Irisin對其處理.
　　6.RNA提取及實時定量qRT-PCR檢測相關基因的表達.
　　7.免疫熒光染色檢測Irisin處理后分化成熟人脂肪細胞內UCP1的表達。
　　8.Western blot檢測Irisin處理后人皮下白色脂肪組織塊中UCP表達和信號

11、通路蛋白的表達。
　　9.統(tǒng)計學分析:本研究所涉及實驗均重復3次及3次以上，結果采用單因素方差分析或Sudents't檢驗。P＜0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1.人成熟脂肪細胞的獲取。
　　2.重組Irisin可以促進scWAT源的人成熟脂肪細胞棕色化:
　　實時定量PCR和免疫熒光結果顯示重組irisin處理人成熟脂肪細胞4天后，UCP1基因和蛋白水平明顯增高.
　　3.重組ir

12、isin抑制脂肪前體細胞分化和棕色化:
　　在原代脂肪前體細胞向成熟脂肪細胞分化整個過程中加入重組irisin處理18天，成熟的脂肪細胞數(shù)目較未處理組明顯減少，白色脂肪細胞分化的相關基因表達明顯降低，同時UCP1基因和蛋白水平也均明顯降低。
　　4.Irisin通過激活ERK和p38信號通路促進新鮮皮下白色脂肪塊棕色化:
　　(1)重組irisin處理新鮮皮下脂肪塊4天后，western blot檢測UCP1蛋白水平明

13、顯增高，且不同人對irisin反應不同。
　　(2)Western blot結果顯示，Irisin分別處理新鮮皮下脂肪塊10，20，30，60分鐘后，脂肪組織中磷酸化ERK和p38水平均明顯升高。
　　(3)用U0126（ERK抑制劑）和SB203580(p38抑制劑)分別抑制irisin誘導的ERK和p38磷酸化后， Western blot實驗結果顯示，兩種抑制劑均明顯降低irisin所致的UCP1增加。
　　5.

14、人皮下脂肪組織中褐色基因的基礎表達水平和對irisin刺激后的棕色化反應正相關:
　　(1)定量PCR顯示不同人來源的脂肪組織塊對重組Iris in所引起的棕色化反應不同。
　　(2)不同人來源的脂肪組織塊褐色脂肪基因的基礎水平表達不同。
　　(3)人皮下脂肪組織中褐色基因的基礎表達水平和對irisin刺激后的棕色化反應正相關。
　　結論:
　　1.重組irisin可以促進人皮下成熟脂肪細胞棕色化。