人脂肪來源干細胞構(gòu)建組織工程化脂肪組織的體內(nèi)外實驗研究.pdf

1、[背景及目的] 隨著修復重建外科的發(fā)展，自體組織移植及人工材料替代修復軟組織缺損成為重要的治療手段，盡管這能有效地改善受區(qū)的組織缺損狀況，但自體移植物的來源，血供及其供區(qū)的繼發(fā)畸形都限制了它的使用。此外，還有其它多種多樣的方法也被嘗試，包括自體真皮移植，自體脂肪細胞游離移植，膠原注射，人工材料填充等等。但這些方法的治療效果也不十分理想：例如人工材料的移植排斥反應(yīng)，游離脂肪移植后的吸收且吸收率難以預測等。盡管修復軟組織缺損的方法較

2、多，卻難以完全滿足臨床的需要。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為臨床上更好的解決組織缺損等難題提供了一個新的思路。 組織工程技術(shù)能以少量種子細胞，經(jīng)體外擴增后與生物材料復合，修復較大的組織或器官缺損，重建生理功能，為真正實現(xiàn)無損傷修復組織缺損和真正意義上的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與功能重建開辟了新的途徑。組織工程學的發(fā)展需要幾個必備的因素，即：(1)可獲得的種子細胞，并能控制其生長和組織形成；(2)結(jié)構(gòu)精確的三維支架，以適合再造需要的組織量和形狀，而且與細

3、胞具有良好的組織相容性；(3)適宜的微環(huán)境，能提供充分的血供和營養(yǎng)，維持細胞增殖和組織功能。 目前已證實脂肪組織中存在類似骨髓基質(zhì)細胞的間充質(zhì)干細胞，且被命名為脂肪組織來源的干細胞(ASCs)。這種干細胞經(jīng)證實同樣具有體內(nèi)外多向分化誘導潛力，如能向脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肌肉細胞及心肌細胞定向轉(zhuǎn)化，對多種組織的損傷具有良好的修復作用，而且取材方便，獲取量大，不易造成供區(qū)繼發(fā)畸形等，已作為組織工程研究中的重要種子細胞。

4、 組織工程常用的支架材料分為天然材料和人工合成材料，天然材料包括：天然多糖類材料有纖維素、甲殼素、透明質(zhì)酸等；天然蛋白質(zhì)類材料有膠原和纖維蛋白等；人工合成的材料有聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)或兩者聚合物聚乳酸一聚乙醇酸(PLGA)、聚四氟乙烯、羥基磷灰石、聚乙烯醇、海藻酸鹽等。依據(jù)他們各自特點，被不同程度地應(yīng)用于組織工程的研究。由于應(yīng)用脂肪細胞組織工程技術(shù)修復軟組織缺損近期才引起學者們的關(guān)注，故而用于構(gòu)建脂肪組織工程有效的生物

5、材料支架研究不多，主要為可降解的多孔泡沫，如PLGA、透明質(zhì)酸、膨體聚四氟乙烯等，然而，究竟何種材料能成為脂肪組織工程種子細胞的理想載體尚不十分明確，且關(guān)于脂肪組織工程的研究國內(nèi)報道甚少，對這一課題進行廣泛深入的探討具有深遠意義。 本實驗研究了人AsCs向脂肪組織的體外定向誘導分化能力，同時判斷種子細胞ASCs與Ⅰ型固態(tài)膠原支架及纖維蛋白膠可注射支架復合后在體內(nèi)構(gòu)建組織工程化脂肪組織的可能性，以尋找適宜的脂肪組織工程種子細胞載體

6、，探索構(gòu)建組織工程化脂肪組織的有效方法；另外，對ASCs進行DiI體外熒光標記，觀察該標記物對細胞生物性狀的影響，為脂肪干細胞研究尋找理想的細胞標記方法。 [材料與方法] 一、成人脂肪來源干細胞(ASCs)的分離培養(yǎng)及鑒定取人吸脂術(shù)抽吸物的脂質(zhì)部分，使用酶消化法進行原代培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)及功能變化，細胞傳至第3代后供實驗用。利用流式細胞儀檢測細胞表面部分與干細胞相關(guān)的分子如CD29、CD34、CD44，確定細胞類型；同時

7、對細胞進行體外定向成脂、成骨誘導分化，并以油紅O染色及茜素紅染色進行鑒定。 二、脂肪干細胞體外Dil熒光標記及觀察標記物對細胞生物性狀的影響熒光染料DiI體外標記ASCs，倒置顯微鏡及熒光顯微鏡觀察細胞生長情況及傳代后熒光強度的變化；檢測細胞標記后成脂能力。使用xTT比色分析法檢測接種細胞增殖率，同時將培養(yǎng)細胞上清液進行乳酸脫氫酶(LDH)含量測定，檢測熒光染料的細胞毒性。 三、以Ⅰ型膠原固態(tài)支架為載體材料構(gòu)建組織工程化

8、脂肪組織的實驗研究 1．細胞一支架復合物體外生物相容性檢測將脂肪干細胞接種于支架材料形成復合物，顯微鏡下觀察細胞生長情況，進行XTT比色分析檢測接種細胞增殖率；同時將培養(yǎng)細胞上清液進行乳酸脫氫酶(LDH)含量測定，檢測材料的細胞毒性；Dil標記前后細胞一支架粘附率檢測；最后掃描電鏡觀察DiI標記前后細胞與載體的黏附性。 2．體內(nèi)構(gòu)建組織工程化脂肪組織將Ⅰ型膠原支架與DiI標記的成脂誘導后ASCs混合體外培養(yǎng)三天，設(shè)空白支

9、架為對照組，同體雙側(cè)植入裸鼠背部皮下，12周后取出植入物。進行組織工程新生物大體觀察和濕重測定后熒光顯微鏡觀察大體組織標本，最后組織學檢測、油紅O染色定性。 四、以纖維蛋白膠可注射支架為載體材料構(gòu)建組織工程化脂肪組織的實驗研究1．細胞一支架復合物體外生物相容性檢測纖維蛋白膠由A(纖維蛋白原)、B(凝血酶)兩液組成，將A液與脂肪干細胞混合，A、B兩液分開抽入雙聯(lián)注射器中，通過一混合管使兩液混合，體外形成細胞一凝膠復合物，顯微鏡下觀

10、察細胞生長情況，進行XTT比色分析檢測接種細胞增殖率；同時將培養(yǎng)細胞上清液進行乳酸脫氫酶(LDH)含量測定，檢測材料的細胞毒性；檢測DiI標記前后細胞一支架粘附率；掃描電鏡觀察DiI標記前后細胞與載體的黏附性。2．體內(nèi)構(gòu)建組織工程化脂肪組織將A液與標記DiI的成脂誘導后ASCs混合制成細胞懸液，雙聯(lián)注射器將A、B兩液混合后同體雙側(cè)注入裸鼠背部皮下，設(shè)空白支架為對照組，12周后取出注入物。進行組織工程新生物大體觀察和濕重測定后熒光顯微鏡觀

11、察大體組織標本，最后組織學檢測、油紅O染色定性。 [結(jié)果] 1．原代培養(yǎng)的ASCs形態(tài)類似于成纖維細胞，具有很強的增殖及多向分化能力。在脂肪及成骨分化培養(yǎng)基的作用下，分化出成熟的脂肪細胞和成骨細胞，油紅o、茜素紅染色陽性。實驗檢測到細胞表面抗原分子CD29、CD34、CD44持續(xù)表達，說明其具有干細胞特性。 2．DiI標記脂肪干細胞陽性率為100％，該熒光染料不破壞細胞，不干擾細胞增殖，體外培養(yǎng)一周內(nèi)未見熒光減弱

12、，當細胞傳至第三代后，熒光有所減弱，第六代細胞熒光明顯降低，熒光標記陽性率不到30％。 3．兩種支架均與ASCs有良好的相容性及黏附性，對細胞無毒性，不影響細胞增殖；兩組實驗組均在裸鼠皮下發(fā)現(xiàn)新生組織塊，膠原支架組新生物平均濕重為0.019g，纖維蛋白膠支架組新生物平均濕重為0.028g，常規(guī)病理切片及油紅O染色均證實其為成熟脂肪組織，熒光顯色陽性證實其為外源性。兩組空白支架對照組未見脂肪組織形成。 [討論] 軟

13、組織缺損的修復重建是整形外科面臨的重大挑戰(zhàn)。針對小范圍軟組織缺損，臨床多采用游離脂肪移植技術(shù)。但游離移植的脂肪顆粒由于缺乏有效的血液供應(yīng)，僅僅只有40％-60％體積的能存活，而且這種存活率術(shù)前還難以估計。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為解決上述難題提供了一種革命性的思路。通過這項技術(shù)的應(yīng)用，我們就有可能獲得足夠體積的自體軟組織來源。成人的間充質(zhì)干細胞被證實能被誘導分化為多種細胞系。在脂肪組織中也被證實包含這種具有多向分化潛力的細胞。脂肪組織類似于人

14、類骨髓，同樣來自于中胚層而且有研究已經(jīng)證實在脂肪基質(zhì)中包含有多能干細胞。這種干細胞被命名為脂肪組織來源干細胞，縮寫為ASCs。 ASCs作為種子細胞與其他細胞相比具有相當?shù)牡膬?yōu)越性，首先，ASCs容易獲得，對患者造成的痛苦小。對于肥胖者又需組織工程種子細胞進行整形治療的患者尤其適合。其次，這種細胞在體外增殖速度快，傳代培養(yǎng)可獲得大量有分化能力的細胞。 在這個實驗中，ASCs能在體外分化為成熟的脂肪細胞，而且脂肪分化誘導后

15、的ASCs(adipo．ASCs)與Ⅰ型膠原支架混合培養(yǎng)后能在裸鼠皮下新生結(jié)構(gòu)功能完整的脂肪組織塊。該研究提示，ASCs作為種子細胞的確可以應(yīng)用于脂肪組織的組織工程研究，并且能合成具有三維結(jié)構(gòu)及功能的脂肪組織。 特別值得一題的是，相對整形重建外科而言，術(shù)后瘢痕是需要重點考慮的因素。傳統(tǒng)的片狀或海綿狀支架材料都不可避免要在受區(qū)做切口方可植入，這不可避免會殘留瘢痕。在我們實驗中，我們使用纖維蛋白膠可注射支架構(gòu)建組織工程化脂肪組織也獲