VEGF基因轉(zhuǎn)染脂肪組織來源干細胞提高游離脂肪移植存活率的研究.pdf

1、背景: 自體脂肪組織作為理想的軟組織填充材料，因其生物相容性優(yōu)于人工組織代用品、異體及異種材料，且無免疫排斥現(xiàn)象，從而得到了廣泛應(yīng)用。自Neuber于1893年率先應(yīng)用多個自體游離的小脂肪塊填充軟組織缺損以來至今已達一百多年，然而移植脂肪組織顆粒的高吸收率和低存活率的問題一直在困擾著整形外科學(xué)者。 組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，自體脂肪移植后的再血管化最早發(fā)生于手術(shù)后48小時，早期的營養(yǎng)供應(yīng)主要依賴供體周圍組織液的血漿營養(yǎng)，但這種營養(yǎng)

2、供應(yīng)是有限的，再血管化不及時或不充分將極大的影響脂肪細胞的存活，導(dǎo)致其變性、壞死、形成囊腔并逐漸吸收。因此，及時、充分的再血管化可能是有效提高脂肪移植存活率的關(guān)鍵。 血管生物學(xué)研究表明，一些細胞因子在改善缺血組織存活率方面扮演了重要的角色，其中之一就是血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）。關(guān)于外源性VEGF促進皮瓣等缺血組織新生血管的形成已有相關(guān)報導(dǎo)。然而，外源性細胞因子所能夠發(fā)揮的療效極大地受制于移植物中血管內(nèi)皮細胞的數(shù)目。因此，

3、另一種研究的思路就是設(shè)法增加移植物中內(nèi)皮細胞的數(shù)量。2001年ZUK和ZHU首次從人抽脂術(shù)獲得的脂肪組織中分離得到具有多向分化潛能的干細胞，稱為脂肪組織來源的干細胞（ASCs），引起廣大學(xué)者的關(guān)注。抽脂術(shù)分離ASCs具有獲取途徑簡單、獲得率高，對病人創(chuàng)傷小等優(yōu)點。研究表明，ASCs具有分泌細胞因子促進血管形成，并具有向脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、內(nèi)皮細胞、心肌細胞、平滑肌細胞、神經(jīng)元細胞、血管內(nèi)皮祖細胞等方向分化的潛能。但這些僅是在體外

4、特定的定向誘導(dǎo)條件下ASCs表達了不同系細胞的特征，體內(nèi)組織細胞的生長受到神經(jīng)、體液和周圍環(huán)境等諸多因素的影響，ASCs在體內(nèi)環(huán)境下是否具備向不同系分化的能力尚未明了。 就目前的研究而言，不論是國內(nèi)或是國外文獻，尚未見將血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）與脂肪干細胞聯(lián)合治療提高游離脂肪移植存活率的報導(dǎo)。 目的: 探索ASCs在體內(nèi)是否能促進游離移植脂肪組織血運的重建，從而提高脂肪組織的存活率，研究ASCs輔助移植做

5、為一種細胞療法的可行性。同時還研究了VEGF基因轉(zhuǎn)染ASCs聯(lián)合治療能否進一步增強這種療效。 方法: 1．脂肪組織來源干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定 取人吸脂術(shù)抽吸物的脂質(zhì)部分，使用酶消化法進行原代細胞培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)及功能變化，以第三代ASCs行成脂、成骨、成軟骨分化鑒定。 2．DiⅠ標(biāo)記人脂肪干細胞 紅色熒光染料DiⅠ體外標(biāo)記ASCs，倒置顯微鏡及熒光顯微鏡觀察細胞生長情況。 3．

6、Ad-VEGF165體外轉(zhuǎn)染ASCs及轉(zhuǎn)染后目的基因表達 前期實驗發(fā)現(xiàn)腺病毒轉(zhuǎn)染ASCs時，感染復(fù)數(shù)（MOI）值為50時較理想，轉(zhuǎn)染率可達到90%以上，故按50進行轉(zhuǎn)染。通過免疫細胞熒光檢測VEGF在細胞內(nèi)的表達情況，同時利用ELISA測定細胞培養(yǎng)上清液中VEGF濃度水平。 4．脂肪移植模型制備及分組 將A、B、C、D四組移植物隨機注入每只裸鼠背部皮下：A組為轉(zhuǎn)染了VEGF的ASCs與脂肪組織混合物；B組為未轉(zhuǎn)染

7、VEGF的ASCs與脂肪；C組為胰島素與脂肪混合物；D組為培養(yǎng)基與脂肪混合做為空白對照。 5．脂肪移植術(shù)后觀察 術(shù)后6個月對游離移植脂肪組織進行觀察，指標(biāo)有：（1）各組脂肪組織濕重測定；（2）纖維化及壞死程度的測定；（3）移植物中毛細血管數(shù)目；（4）移植物中毛細血管內(nèi)皮細胞的起源。 6．統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，使用統(tǒng)計軟件SPSS13．0進行數(shù)據(jù)處理。采用重復(fù)測量方差分析，均數(shù)兩兩之

8、間的比較采用LSD檢驗。 結(jié)果; 1．分離培養(yǎng)的ASCs形態(tài)類似于成纖維細胞，具有很強的增殖及多向分化能力。在成脂、成骨及成軟骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下，分化出成熟的脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞，油紅O、茜素紅染色和阿利新藍染色陽性。 2．DiⅠ標(biāo)記后熒光顯微鏡下觀察，見全部脂肪干細胞標(biāo)記后均顯紅色熒光，標(biāo)記的脂肪干細胞呈梭形，胞漿豐富，保持了良好的正常形態(tài)，DiⅠ標(biāo)記陽性率為100%，細胞核未染熒光。該熒光染料不

9、破壞細胞，不干擾細胞增殖，染色效果好，是脂肪干細胞示蹤的好方法。 3．VEGF轉(zhuǎn)染ASCs72小時后，超過90%ASCs免疫熒光染色顯陽性，未轉(zhuǎn)染的ASCs僅有少許熒光染色顯陽性。轉(zhuǎn)染組上清液中VEGF的分泌水平明顯高于非轉(zhuǎn)染對照組（P<0．01）。 4．（1）6個月后各組移植脂肪濕重分別為：VEGF基因轉(zhuǎn)染ASCs組（190．91±29．51mg），ASCs組（165．90±32．47mg），胰島素組（98．45±13

10、．36mg），培養(yǎng)基對照組（71．69±15．59mg），各組之間兩兩比較有統(tǒng)計學(xué)差異。（2）組織學(xué)切片觀察結(jié)果：C、D組移植物中大部分脂肪壞死，大量纖維組織增生。A、B組存活的脂肪結(jié)構(gòu)保持較完整，纖維增生明顯少于對照組。（3）毛細血管計數(shù)結(jié)果：四組移植物的血管密度計數(shù)分別為A組（42．17±5．80）個/20HP，B組（16．89±6．15）個/20HP，C組（6．67±2．99）個/20HP，D組（2．28±0．75）個/20HP。

11、A組毛細血管數(shù)目顯著多于其余三組，B組也有較多的毛細血管，C、D組僅有少許血管分布其中。（4）移植物中毛細血管內(nèi)皮細胞的起源：DiⅠ標(biāo)記的發(fā)出紅色熒光的ASCs存在于A、B組移植物的部分血管中，并散在分布于部分脂肪細胞中。小鼠抗人CD31及山羊抗小鼠IgG-FITC標(biāo)記顯示出綠色熒光的血管環(huán)。圖像疊加證實，ASCs在體內(nèi)能夠部分轉(zhuǎn)化為血管內(nèi)皮細胞及脂肪細胞。B、C組熒光顯微鏡觀察未見血管環(huán)，僅有一些本底熒光。 討論: 目

12、前，游離脂肪移植仍存在高吸收率和低存活率的問題。游離的脂肪組織移植到受區(qū)以后，其血液供應(yīng)是成活的基礎(chǔ)。早期的營養(yǎng)供應(yīng)主要依賴供體周圍組織液的血漿營養(yǎng)，但這種營養(yǎng)供應(yīng)是有限的，不能保證供體的長期存活，僅能幫助其渡過早期的缺血缺氧狀態(tài)。移植48小時后，供體組織開始與受區(qū)血管床建立新的血液循環(huán)，此再血管化過程是游離移植能否成功的決定因素，再血管化不及時或不充分都會導(dǎo)致供體組織發(fā)生壞死。因此探索促進游離移植脂肪組織再血管化的手段，是整形外科技術(shù)

13、發(fā)展的迫切需要。 細胞療法可能是解決脂肪移植后早期再血管化問題的一種有效辦法。 細胞療法是指應(yīng)用自體、異體或同種異體的細胞，經(jīng)體外操作后回輸（或植入）人體，以達到治療、診斷或預(yù)防作用的目的。細胞療法最初和最成功的范例是輸血和骨髓、造血干細胞移植。近年來，隨著人們對于細胞研究的不斷深入，細胞療法的治療領(lǐng)域不斷拓寬，延伸到了腫瘤的生物治療、免疫治療，糖尿病、冠心病、促進血管生成和創(chuàng)面愈合等領(lǐng)域。研究表明，ASCs具有分泌細胞

14、因子促進血管形成，并具有向脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、內(nèi)皮細胞等方向分化的潛能。ASCs與其它的干細胞相比有顯著的優(yōu)越性：①ASCs容易獲得，對患者造成的痛苦小。②ASCs在體外增殖速度快，不必進行永生化處理就能獲得足夠量的細胞用于移植。③ASCs能夠進行自體移植，無免疫排斥的反應(yīng)。 本實驗通過從人抽脂術(shù)獲得的脂肪組織中分離得到的ASCs，與取自人體的脂肪混合移植于裸鼠。實驗結(jié)果表明：裸鼠背部移植的脂肪組織術(shù)后6個月ASCs組移

15、植脂肪組織存活率高于胰島素組及對照組。ASCs組存活的脂肪組織質(zhì)地較軟，脂肪結(jié)構(gòu)保持較完整，脂肪小葉及小葉間隔保持較好，脂肪纖維化及壞死程度低于胰島素組及對照組。熒光示蹤證實ASCs存在于移植脂肪的部分脂肪細胞及小葉間隔中，在體內(nèi)能夠部分轉(zhuǎn)化為血管內(nèi)皮細胞及脂肪細胞，促進了游離移植脂肪組織的再血管化。 血管生物學(xué)研究表明，一些細胞因子在改善缺血組織存活率方面扮演了重要的角色，VEGF作用于血管形成的早期，可以促進血管內(nèi)皮細胞增生

16、，并改善血管的通透性。VEGF應(yīng)用方式一般可分為直接應(yīng)用和間接應(yīng)用。直接應(yīng)用VEGF有其局限性：①VEGF價格昂貴；②難以在體內(nèi)保持持續(xù)的有效濃度；⑨不能自我調(diào)節(jié)。間接應(yīng)用是利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將基因整合進宿主細胞，將一些能產(chǎn)生VEGF的細胞種植在局部組織，使其在較長時間內(nèi)持續(xù)、穩(wěn)定地產(chǎn)生VEGF，能很好地克服直接應(yīng)用的缺陷。本實驗即采用這種間接應(yīng)用的方法，使用ASCs作為載體持續(xù)釋放內(nèi)源性的VEGF。實驗結(jié)果表明，VEGF基因轉(zhuǎn)染ASCs

17、組能有效提高脂肪移植存活率，增加移植物中毛細血管的密度，其療效優(yōu)于未轉(zhuǎn)染的ASCs組。已有很多研究證實VEGF能有力的促進移植物的再血管化，但以ASCs作為載體釋放內(nèi)源性的VEGF以提高游離脂肪移植存活率國內(nèi)外未見文獻報導(dǎo)。 結(jié)論: ASCs在體內(nèi)能夠分化為血管內(nèi)皮細胞及脂肪細胞并促進了游離移植脂肪組織的血運重建，減輕了脂肪組織的纖維化，改善了存活脂肪的質(zhì)地，提高了移植脂肪的存活率。ASCs輔助移植是一種有效的細胞療法