慢性腎衰大鼠脂肪組織RAS活化對(duì)脂肪組織巨噬細(xì)胞表型改變的影響及機(jī)制.pdf

1、研究背景：
　　 慢性腎臟病(CKD)在全世界越來(lái)越多，終末期腎病患者，尤其是接受透析治療的患者死亡率與同齡正常人相比顯著增加。根據(jù)美國(guó)全國(guó)健康與營(yíng)養(yǎng)評(píng)估調(diào)查(NHANES)的數(shù)據(jù)來(lái)看，在1999-2004年這段時(shí)間內(nèi)美國(guó)的CKD（不包括終末期CKD）患病率已經(jīng)達(dá)到13.1％，而同時(shí)段內(nèi)澳大利亞、中國(guó)、印度患者按CKD分期，第3期到第5期的患病率大約為5％。慢性腎臟病患者，尤其是終末期腎病需要透析治療或者腎移植的患者，即使移植物

2、功能在正常范圍內(nèi)，其罹患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)也顯著增加。慢性腎功能不全患者全身炎癥反應(yīng)增強(qiáng)并通常伴隨著胰島素敏感性降低，從而導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)病率和死亡率都增加。
　　 幾乎所有的腎臟病都伴隨著由炎癥因子分泌和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)引起的腎臟炎癥。RAS一直是公認(rèn)的全身血壓和腎臟水電解質(zhì)平衡的重要調(diào)節(jié)器[3]，RAS的主效應(yīng)器AngⅡ在高血壓病血管重構(gòu)中是主要介質(zhì)之一。除了作為強(qiáng)效的血管收縮劑，AngⅡ還能通過(guò)激活氧化還原途徑和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)誘導(dǎo)整

3、合素蛋白、粘附分子、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、促纖維化介質(zhì)，引起活性氧的釋放增加，并且增加NF-κB的核轉(zhuǎn)位，降低內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)的活性，從而起促進(jìn)炎癥的作用。這些促炎癥效應(yīng)可以被ARB阻斷。RAS在高血壓病與心血管疾病(CVD)的發(fā)生發(fā)展和病理生理中起關(guān)鍵作用。
　　 脂肪組織功能正常對(duì)人類健康來(lái)說(shuō)是必不可少的，它作為禁食時(shí)的能量來(lái)源并為體溫調(diào)節(jié)提供隔熱條件，過(guò)去人們一直認(rèn)為脂肪細(xì)胞只是一個(gè)不活躍的能量來(lái)源，但是最近越來(lái)

4、越多研究表明脂肪細(xì)胞合成并分泌大量促炎癥因子如細(xì)胞因子、急性期反應(yīng)蛋白、趨化因子、類花生酸、前列腺素和抗炎細(xì)胞因子如脂聯(lián)素、IL-10?？傊@些脂肪細(xì)胞來(lái)源的因子被稱為脂肪因子。脂肪因子在過(guò)去數(shù)年里一直在增加，現(xiàn)在已知的由脂肪細(xì)胞分泌的脂肪因子有50多種[5]。脂肪組織由脂肪細(xì)胞(30％-50％)和前脂肪細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、血管與免疫細(xì)胞（單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞）組成。多肽類脂肪因子（如脂聯(lián)素、瘦素。內(nèi)脂肪素）由脂肪細(xì)胞分泌，細(xì)胞因子

5、(MCP-1、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白、TNF-α、ILs1β、6、8、10等)由血管基質(zhì)類細(xì)胞分泌，然而這兩者間也有重疊，因?yàn)橛械闹疽蜃油瑫r(shí)由脂肪細(xì)胞和血管基質(zhì)類細(xì)胞分泌(如抵抗素和apelin)[9]。巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)是慢性腎臟病和肥胖的一個(gè)共同特征，但是巨噬細(xì)胞在功能上具有明顯的異質(zhì)性。最近研究表明，巨噬細(xì)胞可以按功能不同分為兩種不同的極性狀態(tài):M1型即“經(jīng)典活化型”巨噬細(xì)胞和M2型“轉(zhuǎn)化型”巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞由經(jīng)典的免疫途徑誘導(dǎo)激活

6、(如LPS和IFN-γ)，并能促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生，如TNF-α、IL-1β、IL-6等。M2型巨噬細(xì)胞可由IL-4和IL-13刺激產(chǎn)生。M2型巨噬細(xì)胞通過(guò)合成抗炎細(xì)胞因子IL-10和IL-1誘導(dǎo)性受體及內(nèi)吞清除作用在炎癥消退和組織修復(fù)中起重要作用。抑制巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)在慢性炎癥模型中對(duì)腎臟損傷具有保護(hù)作用。M1型巨噬細(xì)胞與M2型巨噬細(xì)胞在體內(nèi)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。
　　 長(zhǎng)期以來(lái)，人們認(rèn)為RAS僅調(diào)節(jié)著收縮壓和腎臟電解質(zhì)的平衡

7、，但近十年研究發(fā)現(xiàn)，腎素—血管緊張素系統(tǒng)的多種成分也表達(dá)于多種組織中，如:腎上腺、腎臟、腦、心臟和血管中，并在各臟器局部發(fā)揮著重要作用。隨著肥胖和代謝綜合征的發(fā)生率增加，RAS在脂肪組織的表達(dá)和局部作用也受到了重視。大量研究已證實(shí)，人和鼠的脂肪細(xì)胞中均表達(dá)血管緊張素原(AGT)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)和血管緊張素受體1(AT1)和2(AT2)。簡(jiǎn)要地說(shuō)，肝臟合成并釋放血管緊張素原(AGT)至循環(huán)血液中，腎小球的球旁器中顆粒細(xì)胞分泌腎

8、素，腎素催化血管緊張素原生成AngⅠ，AngⅠ進(jìn)一步由肺毛細(xì)血管上皮細(xì)胞分泌的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)催化生成AngⅡ，即RAS的主要活性成分，AngⅡ通過(guò)與兩種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AT1R和AT2R發(fā)揮生物學(xué)活性[18]。AngⅡ大部分生理功能通過(guò)與AT1R結(jié)合而產(chǎn)生。局部AngⅡ抑制前脂肪細(xì)胞的分化，減少脂肪細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)脂肪細(xì)胞的肥大;血管緊張素Ⅱ還促進(jìn)炎癥因子的釋放，引起脂肪組織炎癥反應(yīng)。有研究證實(shí)，在過(guò)表達(dá)AGT的小鼠脂肪組織中血

9、管生成因子與炎癥因子表達(dá)增加，從而引起局部胰島素抵抗與脂肪組織血管重構(gòu)（血管生成），并且循環(huán)中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)阻止前脂肪細(xì)胞分化，進(jìn)一步介導(dǎo)血管收縮。AngⅡ通過(guò)活化NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)成熟脂肪細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞促炎癥因子釋放，并且AngⅡ能作用于脂肪組織基質(zhì)血管細(xì)胞，如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞發(fā)揮作用，而這些細(xì)胞都能表達(dá)RAS組分。因此，脂肪組織RAS的活化可引起脂肪局部和機(jī)體全身的炎癥反應(yīng)。
　　 之前已經(jīng)有研究證實(shí)在慢性腎

10、衰大鼠脂肪組織內(nèi)存在炎癥反應(yīng)并有RAS活化，但是這兩者之間是否有聯(lián)系尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)旨在證實(shí)慢性腎衰時(shí)脂肪組織RAS活化對(duì)巨噬細(xì)胞表型的影響，并探討其可能的機(jī)制。在體內(nèi)用5/6腎切除大鼠作為慢性腎功能衰竭模型，觀察RAS活化對(duì)脂肪組織炎癥與巨噬細(xì)胞極性的影響，體外實(shí)驗(yàn)則用LPS或mIL-4加AngⅡ刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞觀察AngⅡ?qū)奘杉?xì)胞極性的影響。
　　 研究方法：
　　 體內(nèi)部分
　　 一、二步法5

11、/6腎切除建立慢性腎衰模型
　　 1)腹腔注射麻醉大鼠:給大鼠腹腔注射3％戊巴比妥鈉麻醉，俯臥位固定于鼠臺(tái)上。
　　 2)酒精消毒，于大鼠左腹部中1/3脊柱旁開2-3cm處行縱行切口，切口長(zhǎng)度約為2-3cm。
　　 3)依次切開皮膚和皮下組織，并剪開肌肉暴露腎臟，剝離腎包膜，用無(wú)損傷血管鉗夾住腎蒂，切除腎臟的上下極約占左腎的2/3，明膠海綿壓緊上下極創(chuàng)面止血，放松血管鉗，觀察創(chuàng)面不再滲血后還納腎臟回腹腔，逐層縫合

12、肌層及皮膚，酒精消毒手術(shù)切口?？p合前，腹腔內(nèi)滴注青霉素注射液，預(yù)防感染。假手術(shù)組只做腎包膜剝離術(shù)。
　　 4)一周后，在脊柱右側(cè)中1/3旁開2-3cm縱行切口（切口略高于左側(cè)），分離肌層，游離腎臟，無(wú)損傷血管鉗夾住腎蒂，4號(hào)絲線結(jié)扎腎蒂，切除右側(cè)腎臟，觀察有無(wú)出血，縫合肌層和皮膚，酒精消毒手術(shù)切口。假手術(shù)組只做腎包膜剝離術(shù)。
　　 二、大鼠RAS阻斷劑ARB（替米沙坦）刺激5/6腎切除術(shù)后第12周，將慢性腎衰大鼠隨機(jī)分為

13、3組，第一組不作任何處理，第二組給予替米沙坦15mg/kg/d灌胃，第三組給予肼屈嗪20mg/kg/d灌胃，時(shí)間為4周。大鼠處死前兩天測(cè)鼠尾動(dòng)脈血壓。
　　 三、大鼠血、尿和脂肪組織的留取及處理
　　 1)術(shù)后第16周，測(cè)定大鼠血壓后將大鼠放于代謝籠中，留取24小時(shí)尿，并測(cè)定24小時(shí)尿量與尿肌酐濃度。
　　 2)腹腔注射麻醉大鼠:給大鼠腹腔注射3％戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定于鼠臺(tái)上。
　　 3)腹主動(dòng)脈采

14、血后，采用放血法處死大鼠，測(cè)定血肌酐濃度。
　　 4)酒精消毒皮膚，分離附睪和腹膜后脂肪墊（內(nèi)臟脂肪）及腹股溝脂肪墊（皮下脂肪），迅速放入盛有1×PBS(PH7.4)的培養(yǎng)皿中。
　　 5)PBS反復(fù)清洗脂肪墊，剔除肉眼可見(jiàn)的血管，將脂肪墊剪成小塊，包于錫箔紙中，液氮速凍，-80℃保存。
　　 四、脂肪組織炎癥指標(biāo)NF-κB的檢測(cè)以及STAT1/3與SOCS1/3的表達(dá)Sham組、CRF組、CRF加替米沙坦組、C

15、RF加肼屈嗪組大鼠皮下脂肪組織和內(nèi)臟脂肪組織，按組織重量∶裂解液=1∶4的比例用勻漿器反復(fù)上下勻漿，以上操作均在冰上進(jìn)行，勻漿完全后，13000g，4℃離心40min，去掉漂浮于上層的脂滴，提取中間層的勻漿液，即為脂肪組織的總蛋白，加入SDS(5×)上樣緩沖液，95℃煮沸蛋白，Western Blotting檢測(cè)脂肪組織NF-κβ亞基p-P65、P65、STAT1/3、p-STAT1/3、SOCS1/3的表達(dá)。
　　 五、rea

16、l-time PCR檢測(cè)皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪組織炎癥因子和巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)Sham組、CRF組、CRF加替米沙坦組、CRF加肼屈嗪組大鼠皮下脂肪組織和內(nèi)臟脂肪組織液氮砸碎，按組織重量∶TRIZOL=1∶10的比例勻漿，提取組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR檢測(cè)IL-6、MCP-1、TNF-α、iNOS、IL-1β、Arg1、CD206、dectin的mRNA表達(dá)。
　　 六、統(tǒng)計(jì)方法
　　 所有數(shù)據(jù)均代表3次以上重

17、復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有統(tǒng)計(jì)分析由統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0完成。多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用One-Way ANOVA，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 體外部分
　　 一、RAW264.7巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞采用美國(guó)ATCC細(xì)胞株。復(fù)蘇后在37℃，5％CO2，10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，傳代。細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)接種于培養(yǎng)板，每48小時(shí)換一次液，待細(xì)胞生長(zhǎng)

18、至融合后，換用不含F(xiàn)BS的DMEM中繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)胞處于同步生長(zhǎng)狀態(tài)，然后用于實(shí)驗(yàn)。
　　 二、AngⅡ?qū)PS、IL-4誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化的影響（時(shí)間、濃度效應(yīng)）
　　 巨噬細(xì)胞分別與0.01、1、10umol/L AngⅡ或10ng/mL LPS、100ng/mL mIL-4同孵育16、20、24小時(shí)，并且在濃度和時(shí)間最高點(diǎn)加替米沙坦刺激，收集細(xì)胞提取RNA，qRT-PCR檢測(cè)IL-1β、CD11c、iNOS、Ar

19、g1、CD206、dectin的mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 體內(nèi)部分
　　 一、腎衰大鼠模型的確立在二步法5/6腎切除術(shù)后的第16周，采集大鼠尿液和血液測(cè)定血肌酐和肌酐清除率。在第16周時(shí)，慢性腎衰組大鼠體重和肌酐清除率與假手術(shù)組相比顯著減少(P＜0.05)，而血肌酐和血壓水平顯著升高(P＜0.001)。
　　 二、慢性腎衰對(duì)脂肪組織炎癥和巨噬細(xì)胞極性的影響
　　 1、慢性腎衰促進(jìn)皮下脂肪

20、IL-6、TNF-α、MCP-1、iNOS、IL-1β mRNA的表達(dá)與NF-κB P65亞基磷酸化水平，抑制Arg1、CD206、dectin mRNA表達(dá)CRF組皮下脂肪IL-6、TNF-α、MCP-1、iNOS、IL-1β mRNA的表達(dá)與Sham組相比顯著增加(IL-6:P=0.001;:TNF-α:P=0.029; MCP-1:P＜0.001;IL-1β:P＜0.001;iNOS:P＜0.001);而Arg1、CD206、de

21、ctin mRNA表達(dá)量則比Sham組明顯減少（Arg1:P=0.001; CD206:P=0.001;dectin:P＜0.001）。NF-κB P65磷酸化水平與Sham組相比顯著增強(qiáng)(P=0.002)。CRF組SOCS1的蛋白水平與Sham組相比明顯減弱(P＜0.001)，SOCS3的蛋白水平與Sham組相比明顯減弱(P＜0.001)，STAT1的磷酸化水平比Sham組明顯增強(qiáng)(P=0.001)，STAT3的磷酸化水平比Sham組

22、明顯增強(qiáng)(P＜0.001)。
　　 2、慢性腎衰促進(jìn)內(nèi)臟脂肪IL-6、TNF-α、MCP-1、iNOS、IL-1β mRNA的表達(dá)與NF-κB P65亞基磷酸化水，抑制Arg1、CD206、dectin mRNA表達(dá)CRF組內(nèi)臟脂肪IL-6、TNF-α、MCP-1、iNOS、IL-1β mRNA的表達(dá)與Sham組相比顯著增加(IL-6:P=0.004; TNF-α:P=0.023);MCP-1:P=0.016;iNOS:P＜0.

23、001; IL-1β:P=0.001）;而Arg1、CD206、dectin mRNA的表達(dá)量則比Sham組明顯減少（Arg1:P＜0.001;CD206:P=0.006; dectin:P＜0.001）。NF-κB P65的磷酸化水平與Sham組相比顯著增強(qiáng)(P=0.032);SOCS1的蛋白水平與Sham組相比明顯減弱(P＜0.001)，SOCS3的蛋白水平與Sham組相比明顯減弱(P=0.004)，STAT1的磷酸化水平比Sham

24、組明顯增強(qiáng)(P=0.001)，STAT3的磷酸化水平比Sham組明顯增強(qiáng)（P=0.031）。
　　 3、替米沙坦抑制慢性腎衰皮下脂肪炎癥并改變巨噬細(xì)胞積極性CRF+替米沙坦組皮下脂肪IL-6、TNF-α、MCP-1、iNOS、IL-1βmRNA的表達(dá)與CRF組相比顯著減弱(IL-6: P=0.002:; TNF-α: P=0.008; MCP-1:P＜0.001; IL-1β: P＜0.001; iNOS: P＜0.001)，而

25、Arg1、CD206、dectin mRNA的表達(dá)量則比CRF組明顯增強(qiáng)(Arg1: P＜0.001; CD206-P＜0.001; dectin:P=0.003)，NF-κB P65的磷酸化水平與CRF組相比顯著減弱(P=0.001);SOCS1的蛋白水平比CRF組明顯增強(qiáng)(P＜0.001)，SOCS3的蛋白水平比CRF組明顯增強(qiáng)(P=0.001):STAT1/3磷酸化水平與CRF紅相比明顯減弱(P＜0.001)。
　　 4、

26、替米沙坦抑制慢性腎衰內(nèi)臟脂肪炎癥并改變巨噬細(xì)胞極性CRF+替米沙坦組內(nèi)臟脂肪IL-6、TNF-α、MCP-1、iNOS、IL-1βmRNA的表達(dá)與CRF組相比顯著減弱(IL-6: P=0.006:; TNF-α: P=0.013; MCP-1:P=0.006; IL-1β: P=0.005; iNOS: P＜0.001)，而Arg1、CD206、dectin mRNA的表達(dá)量則比CRF組明顯增強(qiáng)(Arg1: P=0.049; CD206

27、: P=0.006; dectin:P=0.038)，NF-κB P65的磷酸化水平與CRF組相比顯著減弱(P=0.031);SOCS1的蛋白水平比CRF組明顯增強(qiáng)(P＜0.001)，SOCS3的蛋白水平比CRF組明顯增強(qiáng)(P=0.007);STAT1磷酸化水平與CRF組相比明顯減弱(P=0.001)，STAT3磷酸化水平與CRF組相比明顯減弱(P=0.029)。
　　 5、慢性腎衰對(duì)巨噬細(xì)胞極性的影響M1/M2型巨噬細(xì)胞比率以

28、IL-1β/CD206表示，CRF組M1/M2與假手術(shù)組相比顯著性升高(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 慢性腎衰時(shí)脂肪組織存在炎癥反應(yīng)，替米沙坦抑制大鼠脂肪組織炎癥并通過(guò)抑制SOCS1/3的表達(dá)、增加STAT1/3的磷酸化，從而促使巨噬細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)換。
　　 體外部分
　　 AngⅡ?qū)PS與mIL-4誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化的影響AngⅡ以劑量依賴的方式上調(diào)LPS刺激后的巨噬細(xì)胞（RAW264

29、.7細(xì)胞）IL-1β、CD11c、iNOS mRNA的表達(dá)，并在10umol/L時(shí)達(dá)最高(IL-1β: F=168.363，P＜0.001, CD11c: F=23.389, P＜0.001, iNOS: F=60.192, P＜0.001)，抑制mIL-4刺激后的Arg1、CD206、dectin mRNA的表達(dá)(Arg1:F=66.05，P＜0.001，CD206:F=35.013; P＜0.001; dectin: F=42.03

30、2，P＜0.001);同時(shí)AngⅡ以時(shí)間依賴的方式上調(diào)LPS刺激后的巨噬細(xì)胞IL-1β、CD11c、iNOS mRNA的表達(dá)，刺激24小時(shí)IL-1β、CD11c、iNOS mRNA的表達(dá)最高(IL-1β: F=116.085，P＜0.001，CD11c: F=61.221，P＜0.001，iNOS: F=36.728，P＜0.001)，抑制mIL-4刺激后的Arg1、CD206、dectin mRNA的表達(dá)(Arg1:F=148.706