紫杉醇體外誘導(dǎo)大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡及其分子機(jī)制研究.pdf

1、目的： 1．探討紫杉醇的不同藥物濃度、作用時限與大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡過程的關(guān)系，建立紫杉醇誘導(dǎo)大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株凋亡的細(xì)胞研究模型。 2．分析大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞在紫杉醇不同時限作用后，細(xì)胞抑制率、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡相關(guān)的熱點分子Bcl-2家族BH3-only蛋白Puma、Noxa、Bim的mRNA水平的表達(dá)變化，以及BH3-only蛋白與p53 mRNA水平表達(dá)相互之間的關(guān)系，初步探討紫杉醇誘導(dǎo)大鼠C6腦膠質(zhì)瘤

2、細(xì)胞凋亡的機(jī)制。 方法： 1．細(xì)胞培養(yǎng)及藥物濃度和作用時限的確定：大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株KG-099的維持及擴(kuò)大培養(yǎng)；用臺盼藍(lán)染色后檢測KG-099細(xì)胞活率，并選擇細(xì)胞活率在90%以上進(jìn)行傳代培養(yǎng)：MTT法檢測紫杉醇對細(xì)胞的增殖抑制作用，并選擇合適的藥物濃度進(jìn)行下一步實驗。 2．細(xì)胞凋亡的觀察：熒光倒置顯微鏡下觀察0．1μmol/L紫杉醇作用C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，不同時間點（4、8、16、24、48h）細(xì)胞生長情況

3、和細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；選取對數(shù)生長期的C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞用0．1μmol/L紫杉醇以不同時間點（4、8、16、24、48h）進(jìn)行誘導(dǎo)，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的變化。 3．細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究：SYBR Green Real-Time RT-PCR法檢測0．1μmol/L紫杉醇的不同時間點（4、8、16、24、48h）作用C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞后Puma、Noxa、Bim、p53的mRNA水平的表達(dá)。 4．分析上述指標(biāo)在細(xì)胞凋亡過程中

4、的變化及其相互關(guān)系。 結(jié)果： 1．紫杉醇對大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有明顯增殖抑制作用，隨紫杉醇濃度的增加細(xì)胞抑制率逐漸升高，48h細(xì)胞IC50約為0．1μmol/L；細(xì)胞抑制率隨紫杉醇作用時間的延長逐漸升高，48h細(xì)胞抑制率為51．73%。 2．紫杉醇誘導(dǎo)大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞后生長情況和形態(tài)學(xué)變化：細(xì)胞從貼壁好、生長密集、折光性好向貼壁少，細(xì)胞收縮體積變小，數(shù)目減少、折光性差，出現(xiàn)壞死崩解細(xì)胞改變，個別細(xì)胞可見到核

5、碎裂，呈凋亡形態(tài)學(xué)改變。 3．紫杉醇誘導(dǎo)大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞后細(xì)胞凋亡的分析：流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，隨著紫杉醇誘導(dǎo)時間的延長，G2/M期細(xì)胞逐漸增加，S期細(xì)胞逐漸減少；0．1μmol/L紫杉醇作用大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞后24h檢測到明顯凋亡峰，凋亡率為11．34%。 4．紫杉醇誘導(dǎo)大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞后凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Puma、Noxa、Bim、p53的mRNA水平的表達(dá)：SYBR Green Real-Time R

6、T-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Puma、Noxa、Bim和p53 mRNA均可表達(dá)；在紫杉醇誘導(dǎo)下，Puma、Noxa和p53 mRNA表達(dá)隨誘導(dǎo)時間延長呈增高趨勢，Bim mRNA表達(dá)并不受紫杉醇誘導(dǎo)影響。 結(jié)論： 1．紫杉醇對大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，并呈劑量、時間依賴性。 2．紫杉醇可誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡；同時可使大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞阻滯在G2/M期，減少進(jìn)入S期的細(xì)胞數(shù)。