IL-24基因誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、目的：體外培養(yǎng)大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞，將從E.coli DH5α中提取的含有IL-24的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞，檢測(cè)IL-24體外對(duì)C6細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效果，探尋治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的有效方法。
　　方法：用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)E.coli DH5α菌種，從E.coli DH5α培養(yǎng)基中用質(zhì)粒提取試劑盒提取pEGFP-C1載體和pEGFP-IL-24質(zhì)粒，分別用限制性核酸內(nèi)切酶Xho I和EcoR I雙酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，驗(yàn)證提取質(zhì)粒的準(zhǔn)

2、確性，并做質(zhì)粒DNA濃度、純度的測(cè)定。體外培養(yǎng)C6細(xì)胞，用脂質(zhì)體法將提取的pEGFP-C1和pEGFP-IL-24轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞，同時(shí)設(shè)未處理的C6細(xì)胞和加入阿霉素的C6細(xì)胞為對(duì)照組。在熒光顯微鏡下觀察四組細(xì)胞EGFP的表達(dá)，以說(shuō)明是否將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入 C6細(xì)胞中。四組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后用高倍鏡觀察其形態(tài)學(xué)變化；通過(guò)吖啶橙/溴化乙錠熒光染色后的不同顏色，辨別C6細(xì)胞的存活狀態(tài)；用MTT比色法測(cè)定不同時(shí)間C6細(xì)胞的吸光度值，檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況

3、，結(jié)果用-x±s表示，統(tǒng)計(jì)軟件做方差分析，P<0.05時(shí)有顯著性差異。
　　結(jié)果：從含有pEGFP-C1載體的E.coli DH5α菌種中提取的質(zhì)粒DNA，由限制性核酸內(nèi)切酶酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，有一條約4700bp的片段，與預(yù)期的相符。從含有 pEGFP-IL-24的E.coli DH5α菌種中提取的質(zhì)粒DNA，由限制性核酸內(nèi)切酶酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，有兩條條帶，分子量大小約4700bp和660bp，符合pEGF

4、P-C1載體大小和IL-24大小，對(duì)照的未經(jīng)酶切的沒(méi)有小條帶。做質(zhì)粒純度測(cè)定，OD260/OD280約為1.8，質(zhì)粒純度較高。C6細(xì)胞經(jīng)各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了pEGFP-C1和pEGFP-IL-24的C6細(xì)胞有部分發(fā)綠色熒光，而未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞沒(méi)有綠色熒光，可見(jiàn)能夠?qū)①|(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)C6細(xì)胞中，并在細(xì)胞中表達(dá)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，四組細(xì)胞在高倍鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了pEGFP-IL-24和加入阿霉素的C6細(xì)胞，細(xì)胞不貼壁

5、，變圓、皺縮，而轉(zhuǎn)染了pEGFP-C1和未處理的C6細(xì)胞，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈梭形或多角形。四組細(xì)胞經(jīng)吖啶橙/溴化乙錠熒光染色后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了pEGFP-IL-24和加入阿霉素的C6細(xì)胞，細(xì)胞大多呈橘黃或紅色，部分細(xì)胞已裂解，為凋亡細(xì)胞，而轉(zhuǎn)染了pEGFP-C1和未處理的C6細(xì)胞，大多
　　細(xì)胞質(zhì)著綠色，細(xì)胞大而圓，為正常細(xì)胞。MTT比色法顯示，轉(zhuǎn)染了pEGFP-IL-24與加入阿霉素的C6細(xì)胞相比，C6細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著性差異（P

6、>0.05），而轉(zhuǎn)染了pEGFP-IL-24的C6細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)染了pEGFP-C1或未處理的C6細(xì)胞相比，有顯著性差異（P<0.05，P<0.05）。由生長(zhǎng)曲線圖可看出轉(zhuǎn)染了pEGFP-C1和空白對(duì)照的C6細(xì)胞生長(zhǎng)曲線相類(lèi)似，而轉(zhuǎn)染了pEGFP-IL-24和加入阿霉素處理的C6細(xì)胞增殖明顯受抑制。
　　結(jié)論：1、成功提取pEGFP-C1載體和pEGFP-IL-24質(zhì)粒，并經(jīng)酶切、電泳驗(yàn)證了提取質(zhì)粒的準(zhǔn)確性。
　　2、采用脂