AGEs誘導(dǎo)足細(xì)胞表達(dá)MCP-1以及細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、該研究的目的是證明RAGE配體(AGEs和CML)是否能直接誘導(dǎo)足細(xì)胞表達(dá)MCP-1,并了解RAGE激活后的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑.我們使用條件不朽的小鼠足細(xì)胞株進(jìn)行研究.RT-PCR和ELISA的方法檢測小鼠足細(xì)胞的MCP-1的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)的產(chǎn)生.應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察AGEs和CML誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)氧自由基(ROS).Western blotting、EMSA、免疫細(xì)胞染色和免疫組織化學(xué)染色等方法檢測細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶,NF-κB和S

2、p1蛋白的激活.RT-PCR檢測PKC和PI3K在RAGE信號傳導(dǎo)中的作用.結(jié)果顯示1、AGEs可以以時間依賴的方式誘導(dǎo)足細(xì)胞表達(dá)MCP-1基因,AGEs刺激足細(xì)胞4小時時MCP-1的mRNA表達(dá)達(dá)到最高.AGEs和CML均可以以劑量依賴的方式誘導(dǎo)足細(xì)胞表達(dá)MCP1.ELISA結(jié)果提示使用AGEs和CML刺激的足細(xì)胞,8小時起MCP-1蛋白的表達(dá)高于BSA孵育的足細(xì)胞,分別是7.44±1.01,8.06±0.96pg/mg和3.766±

3、0.3pg/mg(p<0.01),24小時后MCP-1的表達(dá)分別增加到87.78±9.32,85.35±9.83和17.95±0.76pg/mg,(p<0.0001).2、RAGE的另外一個配體,S100蛋白,也能以劑量依賴的方式誘導(dǎo)足細(xì)胞表達(dá)MCP-1.RAGE中和抗體完全阻斷了AGEs、CML和S100的作用.3、我們發(fā)現(xiàn)血清饑餓的足細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)存在基礎(chǔ)性的自由氧離子(ROS),AGEs和CML均可以誘導(dǎo)細(xì)胞漿內(nèi)快速產(chǎn)生ROS.N-

4、乙酰-L-半胱氨酸(NAC)可以抑制基礎(chǔ)的和誘導(dǎo)性的ROS形成,而RAGE中和抗體則完全抑制誘導(dǎo)性的ROS產(chǎn)生.NAC也直接抑制了CML以及外源性H2O2誘導(dǎo)的MCP-1的表達(dá).使用CML刺激足細(xì)胞后10分鐘就可以發(fā)現(xiàn)磷酸化的ERK產(chǎn)生,30-60分鐘達(dá)到最高.直到CML刺激足細(xì)胞120分鐘仍沒有發(fā)現(xiàn)磷酸化的P38MAPK和SAPK/JNK表達(dá)或上調(diào).然而使用NAC,AFC預(yù)處理細(xì)胞可以完全防止ERK的激活并抑制MCP-1基因表達(dá),而P

5、D98059雖然阻斷了ERK的激活卻并不能完全抑制MCP-1的mRNA的產(chǎn)生.我們沒有發(fā)現(xiàn)p38MAPK、SPAK/JNK、PI3K和PKC在信號傳導(dǎo)中扮演任何角色.4、在CML的刺激足細(xì)胞60分鐘后,細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和Sp1增加.ERK的磷酸化抑制劑PD98059直接抑制NF-κB的激活,而不影響細(xì)胞核內(nèi)Sp1的表達(dá)增多.Parthenolide和光輝霉素A,NF-κB和Sp1的抑制劑,劑量依賴地抑制MCP-1的基因表達(dá).