17-β雌二醇抑制脂多糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞MCP-1表達(dá)和細(xì)胞遷移.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性免疫炎癥性疾病，從早期的內(nèi)皮損傷激活到末期的血栓綜合癥形成均有炎性反應(yīng)的參與。傳統(tǒng)的動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素(吸煙、高血糖、高血壓或血脂異常)以及機(jī)械損傷也能通過(guò)觸發(fā)動(dòng)脈壁炎癥反應(yīng)，加速動(dòng)脈粥樣硬化損傷的形成。細(xì)胞因子在炎癥通路中處于核心地位，除免疫細(xì)胞之外，血管壁的主要組成成分內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞也能產(chǎn)生細(xì)胞因子，并受細(xì)胞因子調(diào)節(jié)，還能通過(guò)細(xì)胞因子介導(dǎo)，與入侵的單核細(xì)胞、T細(xì)胞、肥大細(xì)胞產(chǎn)生相互作用，引起免疫細(xì)胞的聚

2、集增加，低密度脂蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化損傷，且作為一種“免疫血管記憶”，不斷加劇這一動(dòng)脈粥樣硬化損傷過(guò)程。流行病學(xué)調(diào)查顯示去除其他致動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素的影響，單獨(dú)的慢性炎癥狀態(tài)如呼吸道和泌尿道革蘭氏陰性菌感染也會(huì)增加動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生率。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁中對(duì)熱抵抗、并且只有當(dāng)細(xì)菌崩解后才釋放出來(lái)的非蛋白質(zhì)成分，能強(qiáng)烈誘發(fā)炎癥反應(yīng)，即使健康人群的血清中也可檢測(cè)到

3、LPS的存在。流行病學(xué)調(diào)查顯示血清中LPS濃度高于50pg/mL的受試者發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)較低于平均水平(14.3pg/ml)者高3倍，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明長(zhǎng)期慢性低劑量注射LPS增大高脂血癥家兔，載脂蛋白-E(apolipoprotein-E，apo-E)缺陷小鼠動(dòng)脈粥樣硬化損傷面積，提示LPS促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，LPS能促進(jìn)粘附分子、白細(xì)胞介素、趨化因子等多種炎癥因子的表達(dá)，這些炎癥因子的表達(dá)能促進(jìn)免疫細(xì)胞與血管壁細(xì)胞的相互作

4、用，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化損傷的進(jìn)展。雌激素具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的效應(yīng)，其抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制與多種因素有關(guān)，近年來(lái)的研究顯示，其抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制與抑制炎癥反應(yīng)，尤其是抑制炎癥因子的表達(dá)有關(guān)。去勢(shì)動(dòng)物會(huì)處于輕微的炎癥狀態(tài)，補(bǔ)充雌激素治療能改善這一狀態(tài)，表現(xiàn)為包括MCP-1在內(nèi)的一系列細(xì)胞因子表達(dá)的降低。絕經(jīng)后婦女給與激素替代治療也能降低MCP-1等眾多炎癥因子，提示雌激素可能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)，對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化損傷。
　　 單核細(xì)胞趨

5、化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)是趨化因子CC家族的成員，能吸引單核細(xì)胞向炎癥部位聚集，通過(guò)吸引單核細(xì)胞轉(zhuǎn)移至內(nèi)皮下，轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞，形成并擴(kuò)大動(dòng)脈粥樣硬化損傷，在始動(dòng)和促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展中有重要作用。對(duì)人群動(dòng)脈粥樣硬化源性的周圍動(dòng)脈疾病以及冠心病進(jìn)行的病例對(duì)照研究顯示，MCP-1的表達(dá)隨動(dòng)脈粥樣硬化程度的增加而升高，是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。正常

6、血管幾乎檢測(cè)不到MCP-1，在人和動(dòng)物的動(dòng)脈粥樣斑塊則出現(xiàn)高表達(dá)。ox-LDL、同型半胱氨酸等促進(jìn)AS的介質(zhì)都能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞MCP-1的生成，介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化的早期損傷并作用于動(dòng)脈粥樣硬化的始終。多項(xiàng)研究表明抑制MCP-1，能降低動(dòng)脈粥樣硬化損傷。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)是動(dòng)脈中層的主要成分，其遷移和過(guò)度增殖以及由此引起的大量的細(xì)胞外基質(zhì)合成是動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓

7、和經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)后管腔狹窄等多種心血管疾病的形成過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，過(guò)程復(fù)雜，受多種因素的調(diào)節(jié)，炎癥因素在其中起了重要的中介作用，免疫組織化學(xué)和原位雜交方法顯示，在AS的早期病變中，中膜平滑肌就能合成MCP-1，并且在AS的各個(gè)時(shí)期SMC都可通過(guò)分泌MCP-1而引起血液?jiǎn)魏思?xì)胞遷移至血管壁，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化損傷的形成，抑制MCP-1或阻斷其受體CCR2能抑制血管中層平滑肌細(xì)胞增殖遷移，研究雌激素對(duì)于VSMC的MCP-1表達(dá)的影響及

8、產(chǎn)生的機(jī)制，對(duì)于抑制動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展有一定意義。本研究擬采用siRNA干擾技術(shù)、免疫印跡檢測(cè)、免疫熒光檢測(cè)、酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)等分子生物學(xué)手段，從細(xì)胞和分子水平觀察17β-雌二醇(E2)對(duì)LPS誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)MCP-1表達(dá)和細(xì)胞遷移的影響，并對(duì)與之相關(guān)的信號(hào)通路進(jìn)行探討，從而為雌激素抑制動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制提供新的資料，也為臨床治療動(dòng)脈粥樣硬化提供新的作用靶點(diǎn)。
　　 本研究分為兩個(gè)部分，第一部分：從細(xì)胞和分子水

9、平探討E2對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞MCP-1表達(dá)和細(xì)胞遷移的影響及cav-1蛋白、p38MAPK、NF-κB通路在LPS誘導(dǎo)的MCP-1表達(dá)和細(xì)胞遷移中的作用。劃痕法測(cè)定大鼠VSMC遷移距離結(jié)果表明，應(yīng)用LPS24小時(shí)后促進(jìn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞遷移，較對(duì)照組遷移距離增加；E2預(yù)孵育24小時(shí)抑制LPS誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞遷移距離增加；使用MCP-1的中和劑anti-MCP-1 antibody可以降低LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移距離增加，提示L

10、PS誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移距離增加與MCP-1的表達(dá)有關(guān)。E2與MCP-1的中和劑anti-MCP-1antibody聯(lián)合使用，并未增強(qiáng)anti-MCP-1antibody的作用，表明E2對(duì)LPS誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移距離增加的抑制主要與MCP-1相關(guān)。ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液MCP-1的表達(dá)顯示：LPS能以時(shí)間和濃度依賴的方式促進(jìn)MCP-1的表達(dá)，隨著LPS濃度的增加(0.01-10μg/m1)，MCP-1的產(chǎn)生增加，LPS作用6小時(shí)即

11、可引起MCP-1表達(dá)的升高，24小時(shí)達(dá)高峰，之后有所下降，最高可達(dá)對(duì)照組6倍以上；17β-雌二醇抑制LPS誘導(dǎo)的MCP-1表達(dá)：10-9mol/L至10-6mol/L17β-雌二醇預(yù)孵育24小時(shí)，可以明顯抑制VSMC上MCP-1的生成，抑制率分別為49.5％，46.6％，43.3％，39.1％；10-8mol/L17β-雌二醇預(yù)孵育12h，24h，48h也能抑制LPS誘導(dǎo)的MCP-1的生成，抑制率分別為36.3％，40.1％，43.2％

12、，表明17β-雌二醇通過(guò)抑制MCP-1的表達(dá)抑制平滑肌細(xì)胞遷移。使用信號(hào)通路阻斷劑對(duì)LPS誘導(dǎo)MCP-1生成的機(jī)制研究表明：以β-MCD破壞caveolae的結(jié)構(gòu)，降低cav-1的表達(dá)；使用p38MAPK磷酸化的抑制劑SB203580，抑制p38MAPK的磷酸化；使用PDTC抑制NF-κB激活均能抑制LPS誘導(dǎo)的MCP-1表達(dá)，抑制率分別達(dá)到46.1％，51.5％，54.5％。應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)在血管平滑肌細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染cav-1 s

13、iRNA抑制cav-1表達(dá)、NF-κBp65 siRNA抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄激活、p38MAPK siRNA抑制p38MAPK的磷酸化，也同樣抑制LPS誘導(dǎo)的MCP-1表達(dá)，抑制率為48.6％，52.5％，55.8％，提示cav-1蛋白、p38MAPK通路、NF-κB通路在LPS誘導(dǎo)的MCP-1表達(dá)，以及由MCP-1增加所引起的血管平滑肌細(xì)胞遷移中有重要作用。
　　 第二部分：探討cav-1蛋白、p38MAPK、NF-κB通路在1

14、7β-雌二醇抑制LPS誘導(dǎo)的MCP-1表達(dá)和細(xì)胞遷移中的作用。應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)及免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)情況顯示，與第一部分抑制cav-1蛋白表達(dá)、抑制p38MAPK磷酸化、抑制NF-κB的激活，能抑制LPS誘導(dǎo)的MCP-1表達(dá)的結(jié)果一致，LPS誘導(dǎo)cav-1蛋白表達(dá)的升高、促進(jìn)p38MAPK的磷酸化以及NF-κBp65的核轉(zhuǎn)位激活。用雌激素受體拮抗劑ICI182780阻斷17β-雌二醇的效應(yīng)，能逆轉(zhuǎn)17β-雌二醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的ca

15、y-1蛋白表達(dá)的升高、p38MAPK的磷酸化以及NF-κBp65的核轉(zhuǎn)位激活的抑制，雌激素受體α的選擇性激動(dòng)劑PPT能模擬17β-雌二醇的效應(yīng)，雌激素受體β的選擇性激動(dòng)劑DPN則不能，提示17β-雌二醇能通過(guò)與其受體結(jié)合抑制p38MAPK磷酸化、NF-κB的核轉(zhuǎn)位激活以及cav-1蛋白的表達(dá)，抑制LPS誘導(dǎo)的MCP-1的生成的，雌激素受體α起主要作用。其中p38MAPK的磷酸化介導(dǎo)NF-κBp65的核轉(zhuǎn)位激活，而cav-1蛋白的表達(dá)又是

16、NF-κB依賴的。
　　 綜上所述，本研究以LPS誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的炎癥損傷，觀察17β-雌二醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的MCP-1表達(dá)和血管平滑肌細(xì)胞遷移的影響，并探討這一影響存在的內(nèi)在機(jī)制。結(jié)果表明：LPS可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞MCP-1的表達(dá)，并通過(guò)MCP-1的表達(dá)促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的遷移；17β-雌二醇可抑制LPS誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移，這一抑制作用與抑制MCP-1的產(chǎn)生有關(guān)；17β-雌二醇在血管平滑肌細(xì)胞上所顯示的對(duì)抗LPS誘導(dǎo)