非洲豬瘟病毒環(huán)介導等溫擴增快速檢測方法的建立.pdf

1、非洲豬瘟(ASF)由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起，死亡率高達100％。由于該病毒特殊的免疫逃避機制，目前尚無有效治療手段。雖然我國并無ASF疫情，但隨著各種國際交往的增多，受到該病威脅的可能性也越來越大，建立一種高效靈敏，簡便快捷的非洲豬瘟檢測技術具有很重要的現(xiàn)實意義。環(huán)介導等溫擴增法(LAMP)因其獨特的設計被廣泛應用于各種病原檢測，目前國內外還沒有關于非洲豬瘟LAMP檢測方法的報道。因此本研究建立的ASFV-LAMP方法不但具有實際

2、應用價值，也具有較高的科研意義。 非洲豬瘟P72基因高度保守，是建立核酸快速檢測方法的理想位點。本研究利用生物信息學手段選定了P72基因C端保守序列的一部分作為靶序列，通過PrimerExplorer3.0軟件分析，依據GC含量，末端穩(wěn)定性，二級結構等參數，設計篩選出了4套LAMP引物。由于LAMP的擴增產物片段大都在100到300bp，一旦出現(xiàn)非特異性擴增，則很難分辨。因此本研究為每個擴增產物設計了酶切位點用于后續(xù)的鑒定，以保

3、證實驗的可靠性。以LAMP保守參數進行的擴增結果表明，四套引物中4FIP，4BIP，4F3，4B3引物組擴增效率最佳，產物條帶清晰明顯，且酶切片段大小與預期相符。 使用該引物組建立ASFV-LAMP方法，對LAMP實驗中的幾個重要參數進行了優(yōu)化。包括溫度、鎂離子濃度、內外引物和甜菜堿濃度等。實驗結果表明，鎂離子和內引物濃度對擴增效率影響最為明顯，在鎂離子濃度為8mM，內引物濃度為1.6～2.4μM時效果最好；擴增效率雖與內引物濃

4、度呈正相關，但當內引物濃度超過3.0μM以后，反而對反應產生抑制作用。溫度、外引物、甜菜堿等雖然也能提高擴增效率，但梯度試驗結果顯示，當數值達到一定程度后，影響便不明顯，因此在出現(xiàn)清晰陽性條帶的實驗組中取中間值作為ASFV-LAMP方法的參數，即溫度63℃，外引物終濃度0.2μM，甜菜堿濃度1.0M。 在上述優(yōu)化結果基礎上，初步建立ASFV-LAMP方法。以OIE標準ASFV-PCR檢測方法為參照，進一步進行時間、靈敏度、特異性

5、及可靠性實驗。時間梯度實驗顯示，該方法只需要30分鐘即可完成，大大少于參照PCR方法；對梯度稀釋模板的檢測表明，ASFV-LAMP能夠檢測到5拷貝的模板，且在低拷貝模板檢測中加入Loop引物，能使擴增效率提高至與高拷貝模板相同的水平，而參照的PCR法只能檢測到500個拷貝的模板，ASFV-LAMP的靈敏度是參照PCR的100倍；以豬圓環(huán)病毒2型、豬細小病毒、豬偽狂犬病毒等常見豬DNA病毒基因組為模板進行特異性試驗，沒有出現(xiàn)非特異性擴增；