人大腸癌腫瘤相關(guān)抗原的鑒定及性質(zhì)分析.pdf

1、目的:大腸癌是世界性的惡性腫瘤，發(fā)病率已占到常見腫瘤的第三位，是嚴(yán)重危害生命健康的疾病。早期大腸癌治療以手術(shù)為主，結(jié)合術(shù)后化療，但這些治療仍然難以避免患者面臨的腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。因此尋找大腸癌的腫瘤標(biāo)志物與特異抗原或相關(guān)抗原，早期發(fā)現(xiàn)大腸癌，使患者早期接受手術(shù)治療，提高5年生存率就顯得十分重要。癌胚抗原(CEA)是大腸癌臨床診斷的指標(biāo)之一，但特異性不高。
　　近年來，分子標(biāo)志物在腫瘤治療中的作用日益受到關(guān)注，一些在腫瘤組織特異性表達(dá)或

2、高表達(dá)的腫瘤抗原是腫瘤標(biāo)志物的主要組成部分。研究腫瘤抗原的分子機(jī)制，可以為臨床上腫瘤免疫診斷和治療提供理論基礎(chǔ)。
　　抗體為基礎(chǔ)的免疫治療一直是極有前景的腫瘤治療方法，許多單克隆抗體藥物已經(jīng)被批準(zhǔn)應(yīng)用到臨床治療并有效提高臨床患者的生存率。本研究室成功制備鼠抗人大腸癌單克隆抗體ND-1，可識別人類大分子量結(jié)腸癌細(xì)胞表面抗原LEA。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，百分之九十的大腸癌細(xì)胞系表達(dá)抗原LEA，而46株非大腸癌細(xì)胞系不表達(dá)抗原LEA

3、，人類腫瘤冰凍切片組織和正常胎兒組織也表達(dá)抗原LEA，近千例臨床病理顯示，抗原LEA在正常組織、非大腸癌組織和良性病變中幾乎不表達(dá)或表達(dá)量很低，而對中高分化的大腸癌是較特異的腫瘤相關(guān)抗原。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)LEA的表達(dá)不同于CEA，在大腸癌診斷特異度方面，抗原LEA強(qiáng)于CEA。因此，本文的研究集中鑒定單克隆抗體ND-1的特異性抗原LEA，進(jìn)而探討此蛋白在腫瘤發(fā)生中的作用。
　　90年代第一次建立了重組cDNA表達(dá)文庫的篩選方法，

4、開創(chuàng)了檢測腫瘤抗原的新時(shí)代，通過篩選文庫已克隆出上千種目的基因。為了提高篩選的特異性，在此基礎(chǔ)上，單克隆抗體因其對相應(yīng)靶抗原具有高度的特異性而成為抗腫瘤藥物研發(fā)和腫瘤靶向治療的主要領(lǐng)域，運(yùn)用特異性抗體篩選文庫將更有利于找到靶抗原。因此，本研究構(gòu)建了人大腸癌細(xì)胞系CCL-187 cDNA表達(dá)文庫，用單克隆抗體ND-1篩選文庫得到與腫瘤生物行為相關(guān)的抗原基因。
　　同時(shí)，大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)已成功用于差異蛋白的表達(dá)分析。因此，本文采用質(zhì)譜

5、分析的方法，通過免疫沉淀分離出單克隆抗體ND-1特異結(jié)合的抗原LEA，通過質(zhì)譜鑒定及一系列細(xì)胞生物學(xué)和生化方法驗(yàn)證，最后推測抗原LEA為血影蛋白βⅡ(Beta-Ⅱ spectrin，β2SP)。尤為重要的是，免疫顯微鏡觀察到β2SP特異性的細(xì)胞膜定位;用Beta-Ⅱ spectrin siRNA干擾后，細(xì)胞膜表面抗原LEA的表達(dá)顯著抑制。此外，我們對Beta-Ⅱ spectrin表達(dá)進(jìn)一步研究，結(jié)果表明:β2SP在大腸癌組織表達(dá)和分布與

6、LEA一致。因此，我們認(rèn)為抗體篩選聯(lián)合質(zhì)譜鑒定用于尋找細(xì)胞表達(dá)蛋白的方法是有效的。
　　綜上所述，本文通過一系列研究從抗原LEA鑒定、功能驗(yàn)證等方面，推斷抗原LEA可能為血影蛋白βⅡ，在大腸癌細(xì)胞膜表面的表達(dá)與腫瘤分化和轉(zhuǎn)移相關(guān)。抗原LEA作為新的大腸癌膜表面標(biāo)志，有可能成為腫瘤診斷和治療的新靶標(biāo)。
　　方法:人大腸癌細(xì)胞系CCL-187λZAP cDNA表達(dá)文庫構(gòu)建及篩選:1、從人大腸癌細(xì)胞系CCL-187中提取出總RNA

7、，并純化出mRNA，將mRNA反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。2、雙鏈cDNA經(jīng)酶切、分離、除去小片段。3、大于400bp的雙鏈cDNA連接載體，構(gòu)建表達(dá)文庫。4、采用藍(lán)白篩選和PCR方法來鑒定cDNA文庫并擴(kuò)增。5、單克隆抗體ND-1篩選文庫，獲得陽性克隆。6.、陽性克隆復(fù)篩，體內(nèi)剪切，測序及BLAST同源性分析。鑒定和分析單克隆抗體ND-1特異性結(jié)合抗原LEA∶1、Western Blot檢測單克隆抗體ND-1特異性結(jié)合抗原LEA在大腸癌細(xì)

8、胞系CCL-187中的表達(dá)情況。
　　2、免疫沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析來鑒定單克隆抗體ND-1特異性結(jié)合抗原LEA。3、相互免疫沉淀和免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證質(zhì)譜結(jié)果。4、抗原LEA與β2SP在細(xì)胞表面的特異性定位分析。5、生物素化標(biāo)記純化膜蛋白，Western Blot檢測蛋白定位細(xì)胞膜。6、單克隆抗體ND-1與β2SP抗體競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)。7、siRNA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證質(zhì)譜結(jié)果。8、免疫組織化學(xué)方法檢測LEA及β2SP在癌變組織中的表達(dá)情況。9、鑒定靶蛋

9、白在腫瘤細(xì)胞系的表達(dá)。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了人大腸癌細(xì)胞CCL-187的cDNA表達(dá)文庫:1、構(gòu)建了人大腸癌CCL-187細(xì)胞株cDNA表達(dá)文庫，原始庫容量為2.3×106 pfu/ml，重組率97％。表達(dá)文庫中的cDNA片段平均大小1 kb以上?？梢杂闷渌目贵w或寡核昔酸探針篩選大腸癌的腫瘤相關(guān)基因。2、以單克隆抗體ND-1篩選該文庫，獲得2個(gè)陽性克隆。基因序列分別與Homo sapiens KIAA0141(KIAA0141)

10、，transcript variant2、mRNA和Homo sapiens enolase1，(alpha)(ENO1)，mRNA蛋白基因序列同源。鑒定單克隆抗體ND-1特異性結(jié)合抗原LEA為骨架蛋白:1、首先通過Western blot方法在260kD附近檢測到單克隆抗體ND-1特異結(jié)合抗原LEA，并使用免疫沉淀及一維電泳分離的方法獲得了單克隆抗體ND-1靶抗原，經(jīng)MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定為蛋白Beta-Ⅱ spectrin。2、

11、用商品化抗β2SP抗體與單克隆抗體ND-1做平行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證ND-1結(jié)合的抗原LEA條帶與β2SP蛋白在同一位置;相互免疫沉淀及免疫印跡實(shí)驗(yàn)得到抗β2SP抗體能夠與單克隆抗體ND-1沉淀的抗原雜交，同時(shí)，單克隆抗體ND-1也可以與β2SP免疫沉淀蛋白雜交;免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察到抗原LEA特異性定位于細(xì)胞膜表面;抗體競爭實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抗β2SP抗體和單克隆抗體ND-1競爭和細(xì)胞表面靶抗原結(jié)合;利用siRNA方法抑制β2SP表達(dá)，可以降低抗原LEA