端粒酶與大腸癌相關(guān)性及RNAi沉默hTERT基因治療大腸癌的研究.pdf

1、在我國，消化道惡性腫瘤中大腸癌發(fā)病占有很高的比率。目前以手術(shù)治療為主的綜合治療仍存在局限性，療效不盡人意。因此，能否找到一個有效的分子治療靶點，是豐富大腸癌治療方法和最終應(yīng)用于臨床提高綜合療效的關(guān)鍵。有研究表明，大腸癌標(biāo)本中端粒酶活性表達(dá)高達(dá)85％以上，而正常組織表達(dá)僅5％左右。端粒酶全酶由端粒酶RNA(hTR)、端粒酶相關(guān)蛋白(TPI)和端粒酶催化亞基(hTERT)三部分組成。hTR和TPI在正常組織和腫瘤組織均有表達(dá)，與端粒酶活性無

2、相關(guān)性。而hTERT與端粒酶的活性相一致，hTERT基因是合成端粒酶全酶的限速因素，與腫瘤的關(guān)系尤為密切，因此將端粒酶作為腫瘤分子靶點的研究是極有意義的研究領(lǐng)域。本研究從本院臨床收集30例大腸癌組織、癌旁組織及正常大腸組織，通過對端粒酶活性的檢測，探討端粒酶與大腸癌的相關(guān)性，并進(jìn)一步驗證端粒酶催化亞基(hTERT)的表達(dá)是否與端粒酶活性一致。同時回顧性分析本院178例大腸癌患者病理標(biāo)本中hTERT表達(dá)水平和臨床病理學(xué)參數(shù)之間的相關(guān)性;通

3、過臨床隨訪資料分析，闡明影響大腸癌患者生存預(yù)后的風(fēng)險因素，明確hTERT能否作為判斷大腸癌預(yù)后的標(biāo)志物及作為大腸癌治療的分子靶點。通過RNAi沉默技術(shù)，觀察hTERT沉默對大腸癌細(xì)胞生長增殖和凋亡的影響，最終闡明hTERT基因RNAi沉默技術(shù)對大腸癌靶向治療的可行性。本研究將從細(xì)胞、分子和整體水平上，為開展大腸癌hTERT基因靶向治療提供實驗和臨床依據(jù)。
　　第一部分端粒酶與大腸癌相關(guān)性研究
　　第一章端粒酶活性與大腸癌相關(guān)

4、性研究
　　目的：探討端粒酶與大腸癌相關(guān)性，進(jìn)一步驗證端粒酶催化亞基(hTERT)的表達(dá)是否與端粒酶活性一致。方法：運用PCR-TRAP-ELISA及免疫組織化學(xué)方法對大腸癌組織及其癌旁組織、大腸正常組織各30例檢測端粒酶活性、hTERT的表達(dá)水平，并研究端粒酶與臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系。結(jié)果(1)端粒酶陽性檢出率在大腸癌組織、癌旁組織、大腸正常組織分別為83.33％13.33％3.33％，癌組織中檢出率明顯高于其他組織（P＜0.

5、05）。(2)大腸癌組織端粒酶活性隨組織分化程度變低而升高，低分化大腸癌組織中的端粒酶陽性表達(dá)率高于中分化及高分化大腸癌(P＜0.05)。(3)通過用免疫組化檢測hTERT的表達(dá)與PCR-TRAP-ELISA法檢測得端粒酶活性相比較，顯示端粒酶活性與hTERT表達(dá)具有一致性，兩法檢測無顯著差異。結(jié)論(1)大腸癌組織端粒酶陽性率明顯高于癌旁組織及正常大腸組織，大腸癌組織中hTERT表達(dá)高于癌旁組織及正常組織。(2) hTERT的表達(dá)與端粒

6、酶活性一致。
　　第二章端粒酶催化亞基與大腸癌預(yù)后因素分析
　　目的：通過對178例大腸癌患者的臨床資料回顧性分析，闡明hTERT表達(dá)水平與大腸癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，為大腸癌患者的預(yù)后評估提供一定的理論指導(dǎo)。方法：選取有完整臨床資料的178例大腸癌石蠟包埋組織標(biāo)本及60例癌旁組織標(biāo)本作為實驗組，30例大腸正常組織石蠟包埋標(biāo)本作為對照組。采用免疫組化的方法檢測大腸癌組織中hTERT蛋白表達(dá)水平。查閱病例獲得相關(guān)臨床參數(shù)資

7、料及隨訪資料，分析hTERT表達(dá)水平與大腸癌進(jìn)展及臨床預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：(1) hTERT蛋白在大腸癌組、癌旁組與大腸正常組中陽性率分別為94.4％、6.67％、3.33％，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001);(2) hTERT在大腸癌組織中的表達(dá)與性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑無關(guān)(P＞0.05)，與腫瘤分化程度、浸潤深度、Dukes分期、臨床分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)。(3)經(jīng)多因素Cox模型分析，不同浸潤深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移

8、、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、hTERT表達(dá)4項指標(biāo)是影響大腸癌患者術(shù)后預(yù)后的獨立危險因子;hTERT表達(dá)水平與患者術(shù)后無瘤生存時間呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論：hTERT在大腸癌組織中呈高表達(dá)。經(jīng)多因素Cox分析，大腸癌浸潤深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴轉(zhuǎn)移、hTERT表達(dá)與大腸癌患者預(yù)后存在顯著性相關(guān)，是影響預(yù)后的危險因子。大腸癌組織中hTERT高表達(dá)者預(yù)后相對較差，低表達(dá)者預(yù)后相對較好。
　　第二部分 RNAi沉默hTERT基因治療大腸癌的實驗研究
　　第一

9、章 hTERT基因shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　目的：構(gòu)建人端粒酶催化亞基(hTERT)基因shRNA真核表達(dá)載體質(zhì)粒，為大腸癌RNAi介導(dǎo)的基因治療打下基礎(chǔ)。方法：化學(xué)合成3條hTERT基因siRNA，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染大腸癌細(xì)胞SW480，48h后采用RT-PCR方法篩選出一條對hTERTmRNA有明顯沉默作用的siRNA。將篩選出的siRNA設(shè)計并合成shRNA寡核苷酸片段，退火形成雙鏈后，插入到pGPU6/GFP/Neo真

10、核表達(dá)載體中，并進(jìn)行酶切和測序鑒定。結(jié)果：酶切和DNA測序證實構(gòu)建的ShRNA已插入載體中。結(jié)論：成功構(gòu)建的hTERT基因shRNA真核表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo-hTERT shRNA，為進(jìn)一步開展hTERT基因在人大腸癌細(xì)胞中的作用機制及體內(nèi)外RNAi實驗研究奠定了基礎(chǔ)。
　　第二章 RNAi沉默hTERT基因?qū)Υ竽c癌SW480細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　目的：觀察hTERT基因?qū)W480細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。方

11、法：將重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT shRNA（hTERT-shRNA）用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入SW480大腸癌細(xì)胞，含無效序列的pGPU6/GFP/Neo-NC shRNA(NC-shRNA)作為陰性對照，單純SW480細(xì)胞作為空白對照，等量轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體作為脂質(zhì)體對照組，分別于轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h，在熒光顯微鏡下觀察重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。采用MTT法檢測各組細(xì)胞的生長增殖情況，RT-PCR法檢測不同轉(zhuǎn)

12、染時間細(xì)胞hTERT mRNA的表達(dá)水平，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測hTERT特異性蛋白表達(dá);PCR-TRAP-ELISA法檢測轉(zhuǎn)染后48小時端粒酶活性;流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期分布，TUNEL法和透射電鏡觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡變化及線粒體膜電位(MMP)的改變檢測。結(jié)果：(1) hTERT-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24h、48h及72h比較，轉(zhuǎn)染48h其轉(zhuǎn)染效率明顯高于24h和72h的轉(zhuǎn)染效率，質(zhì)粒與脂質(zhì)體比例為1∶2.5時，其轉(zhuǎn)染效率顯著高于其它

13、各組，轉(zhuǎn)染率達(dá)59％。(2) MTT檢測結(jié)果顯示:hTERT-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組對SW480細(xì)胞的生長增殖有明顯抑制作用，于轉(zhuǎn)染后第2d達(dá)到峰值，增殖率減少達(dá)28.22％，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(3)半定量RT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48小時的hTERT-shRNA組的hTERT mRNA表達(dá)量明顯低于轉(zhuǎn)染24h和72h組的表達(dá)量。轉(zhuǎn)染48小時的hTERT-shRNA組和空白對照組、脂質(zhì)體對照組、NC-shRNA

14、組比較，其抑制率分別是39.20％，33.28％，27.95％。(4)免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果示:hTERT-shRNA組染色陽性細(xì)胞明顯少于對照組。經(jīng)病理圖像分析軟件進(jìn)行灰度測量后比較發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染48h的hTERT-shRNA組較空白對照組灰度值下降約30.2％，同時和脂質(zhì)體對照組和NC-shRNA組相比，差異均有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。(5)PCR-TRAP-ELISA端粒酶活性檢測顯示:較空白對照組相比，hTERT-shRNA轉(zhuǎn)染組

15、細(xì)胞端粒酶活性下降了18.7％，與較其它三組之間差別均有顯著性意義(P＜0.05)。(6)流式細(xì)胞術(shù)檢測:與對照組比較，hTERT-shRNA組G0/G1期細(xì)胞顯著增加。與NC-shRNA組比較，hTERT-shRNA組增殖指數(shù)(PI)下降14.2％，差別有顯著學(xué)意義（P＜0.05）。(7) TUNEL法檢測:hTERT-shRNA組凋亡細(xì)胞數(shù)顯著多于對照組，因而其凋亡指數(shù)較其它組也明顯增高，hTERT-shRNA組較空白對照組AI增高

16、20％。(8)轉(zhuǎn)染48h后透射電鏡觀察:可見凋亡細(xì)胞體積明顯縮小，表面突起和微絨毛減少，甚至消失，染色質(zhì)不均勻地地沿核膜下聚集。部分可見細(xì)胞核新月體，空泡形成增多。(9)與空白對照組相比，轉(zhuǎn)染48h后線粒體跨膜電位(MMP)顯示:hTERT-shRNA組線粒體Rhodamine123熒光強度明顯增強（增加約24.2％），MMP顯著下降，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論：RNAi沉默hTERT基因能有效抑抑制SW480

17、腫瘤細(xì)胞生長和增殖，并降低端粒酶活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　第三章 RNAi沉默hTERT基因治療大腸癌移植瘤的動物實驗研究
　　目的：探討重組pGPU6/GFP/Neo-hTERT shRNA質(zhì)粒對SW480細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長抑制作用。方法：(1)經(jīng)皮下接種SW480細(xì)胞株(1×107個細(xì)胞/只)建立裸鼠人大腸癌細(xì)胞移植瘤模型。(2)24只裸鼠隨機地分為3組，每組8只。以瘤內(nèi)接種pGPU6/GFP/Neo-hTERT

18、shRNA（簡稱hTERT-shRNA）質(zhì)粒組為實驗組，以瘤內(nèi)注射pGPU6/GFP/Neo-NCshRNANC（簡稱NC-shRNA）作為陰性對照，以瘤內(nèi)注射生理鹽水作為空白對照組。(3)觀察各組裸鼠皮下腫瘤生長情況，繪制腫瘤生長曲線，計算腫瘤抑制率。(4)治療結(jié)束后取標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)檢查、hTERT mRNA及hTERT蛋白表達(dá)分析，端粒酶活性及組織凋亡檢測。結(jié)果：(1)所有裸鼠均于7天后可見皮下腫瘤形成。(2) hTERT-shRN

19、A組裸鼠腫瘤生長較慢，生理鹽水對照組和NC-shRNA陰性對照組裸鼠腫瘤仍較快增大。(3)hTERT-shRNA組腫瘤組織切片HE染色，部分腫瘤可見大片壞死區(qū)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失。生理鹽水組和NC-shRNA組腫瘤生長良好，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，可見病理性核分裂相。(4)半定量RT-PCR檢測hTERTmRNA水平，發(fā)現(xiàn)hTERT-shRNA組較生理鹽水對照組和NC-shRNA陰性對照組分別下降52.1％和48.3％，差異具有顯著性意義(P＜0.0

20、1)。(5)免疫組化結(jié)果表明:hTERT-shRNA組腫瘤組織中hTERT陽性細(xì)胞明顯減少，蛋白表達(dá)下調(diào)。hTERT蛋白平均灰度較生理鹽水組和NC-shRNA組分別降低19.9％和14％。(6)端粒酶活性檢測表明，pGPU6/GFP/Neo-hTERT組較生理鹽水組和NC-shRNA組端粒酶活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。端粒酶活性抑制率分別為48.5％和53.0％。(7) TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)，hTERT