ASIC1a蛋白和polyQ擴(kuò)展突變型ataxin-3蛋白表達(dá)量之間相互影響的研究.pdf

1、目的:在SCA3/MJD細(xì)胞模型中明確ASIC1a與ataxin-3蛋白表達(dá)量之間的相互影響，在細(xì)胞水平初步探討ASIC1a在SCA3/MJD發(fā)病機(jī)制中的作用，以期為SCA3的發(fā)病機(jī)制及臨床治療研究提供新的線索。
　　方法:
　　1、將質(zhì)粒pEGFP-N1-ataxin-3-20Q/70Q轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，構(gòu)建SCA3/MJD細(xì)胞模型。
　　2、調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)液分別為DMEM培養(yǎng)基（pH=7.4，以下簡(jiǎn)稱DMEM培養(yǎng)

2、基）、 pH=7.4的緩沖液、pH=6.0的緩沖液，Western印跡檢測(cè)ataxin-3蛋白的表達(dá)量，明確細(xì)胞培養(yǎng)液pH值改變是否影響ataxin-3蛋白的表達(dá)量。
　　3、在細(xì)胞培養(yǎng)液中依次加入不加和加入50μM、100μM、150μM的ASIC1a抑制劑鹽酸阿米洛利(5-N，N-dimethyl amiloride，DMA)，Western印跡檢測(cè)ataxin-3蛋白的表達(dá)量，明確DMA對(duì)ataxin-3蛋白表達(dá)量的影響。<

3、br>　　4、將質(zhì)粒pCMV-HA-ASIC1 a和pEGFP-N1-ataxin-3-20Q/70Q共轉(zhuǎn)HEK293細(xì)胞，構(gòu)建表達(dá)ASIC1a的SCA3/MJD細(xì)胞模型。通過調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)液pH值激活A(yù)SIC1a，Western印跡檢測(cè)ataxin-3蛋白的表達(dá)量;在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度DMA，Western印跡檢測(cè)ataxin-3蛋白的表達(dá)量，明確激活或抑制ASIC1a對(duì)ataxin-3蛋白表達(dá)量的影響。
　　5、將質(zhì)粒pC

4、MV-HA-ASIC1a和pEGFP-N1-ataxin-3-20Q/70Q共轉(zhuǎn)HEK293細(xì)胞，Western印跡檢測(cè)ASIC1a蛋白表達(dá)量，明確ataxin-3的polyQ擴(kuò)展突變是否影響ASIC1a蛋白的表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　1、在單轉(zhuǎn)僅表達(dá)ataxin-3蛋白的細(xì)胞（無ASIC1a蛋白表達(dá)）中:不同pH處理后的各組細(xì)胞之間，ataxin-3-20Q和ataxin-3-70Q的表達(dá)量在不同pH值組間均無明顯差異;不

5、同濃度DMA處理后的各組細(xì)胞之間，ataxin-3-20Q和ataxin-3-70Q的表達(dá)量亦無明顯的組間差異。
　　2、在ASIC1a與ataxin-3蛋白共表達(dá)的細(xì)胞中:經(jīng)過不同pH處理后的各組細(xì)胞之間，ataxin-3-20Q的表達(dá)量無明顯的組間差異，pH=6.0組其ataxin-3-70Q的表達(dá)量明顯高于另外兩組細(xì)胞(P＜0.01);pH=6.0時(shí)，ataxin-3-70Q的表達(dá)量在加50μM的DMA組與不加DMA組間無明

6、顯差異，但加100μM和150μMDMA的兩組其ataxin-3-70Q表達(dá)量均比不加DMA組明顯減少(P＜0.05和P＜0.01)。
　　3、ASIC1a與ataxin-3共轉(zhuǎn)細(xì)胞經(jīng)不同pH處理后，ataxin-3-70Q組的ASIC1a表達(dá)量均較ataxin-3-20Q組高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、野生型ataxin-3蛋白和ASIC1a蛋白的表達(dá)量之間無相互影響。
　　2、ASIC1a在酸性環(huán)