A39S突變型DJ-1蛋白對(duì)基因表達(dá)譜的影響及DJ-1基因突變檢測(cè)和血清DJ-1蛋白檢測(cè)分析.pdf

1、第一部分 A39S突變型DJ-1蛋白對(duì)基因表達(dá)譜的影響 背景： DJ-1基因是AREP的致病基因之一，所編碼的DJ-1蛋白是個(gè)多功能蛋白質(zhì)，涉及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)、雄激素受體通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤生成、氧化應(yīng)激和線粒體功能等多個(gè)方面。它能通過(guò)調(diào)節(jié)PSF、TH、AR、Nrf2、p53等基因的轉(zhuǎn)錄活性參與多巴胺合成、氧化應(yīng)激及凋亡等PD相關(guān)的病理生理過(guò)程。然而，DJ-1突變?cè)赑D發(fā)病中的具體機(jī)制尚不完

2、全清楚。傳統(tǒng)的研究方法僅局限于研究某個(gè)或某幾個(gè)可能與DJ-1蛋白存在相互作用的蛋白（或基因）及其之間簡(jiǎn)單的調(diào)控關(guān)系，而無(wú)法全面認(rèn)識(shí)在PD發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中所有與DJ-1相關(guān)的蛋白（或基因）及其相互之間的調(diào)控關(guān)系?；蛐酒褪轻槍?duì)這種需要而發(fā)展起來(lái)的一種分子生物學(xué)新技術(shù)。 目的： 應(yīng)用基因芯片技術(shù)探討DJ-1基因致病突變A39S能否通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的變化導(dǎo)致相關(guān)基因表達(dá)異常而參與PD的發(fā)病。 方法： 分別構(gòu)建

3、穩(wěn)定表達(dá)pCMV-Tag2A空載體、pCMV-Tag2A-DJ-1和pCMV-Tag2A-DJ-1-A39S的HEK293單克隆細(xì)胞株；應(yīng)用基因表達(dá)微珠芯片對(duì)穩(wěn)定表達(dá)空載體、野生型DJ-1蛋白、A39S突變型DJ-1蛋白的HEK293單克隆細(xì)胞株進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選。 結(jié)果： 與空載體組比較，野生型DJ-1組有14個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，28個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；A39S突變型DJ-1組有6個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，2個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。A39S突

4、變型DJ-1組與野生型DJ-1組比較發(fā)現(xiàn)UGT287基因表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因分別參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞粘附、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期、蛋白修飾、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、代謝等生物學(xué)過(guò)程，提示A39S突變型DJ-1蛋白可能通過(guò)直接或間接方式對(duì)這些基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控，進(jìn)而影響這些通路的正常功能，參與PD的發(fā)病。 結(jié)論： DJ-1基因的A39S突變能改變DJ-1蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。 第二部分應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量P

5、CR技術(shù)結(jié)合DNA直接測(cè)序技術(shù)檢測(cè)早發(fā)性帕金森綜合征患者DJ-1基因突變 背景： 早發(fā)性帕金森綜合征（early-onset parkinsonism，EOP）是發(fā)病年齡較早（一般≤50歲）的具有帕金森特征的一組綜合征。EOP除具有帕金森病一般特征外，還可伴有晨輕暮重，休息后減輕，肌張力障礙，多巴胺治療早期出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙，腱反射亢進(jìn)等表現(xiàn)。從遺傳方式上看，EOP多呈隱性遺傳。目前研究表明，Parkin、DJ-1、PINK1

6、、ATP13A2等基因突變與EOP發(fā)病有關(guān)。 DJ-1基因是EOP的致病基因之一，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了包括基因外顯子缺失在內(nèi)的20余種DJ-1基因的致病突變，但其突變頻率較低，在EOP中可能僅占1％～2％或是更低。外顯子重排突變可能以雜合的形式存在，PCR擴(kuò)增時(shí)這些有重排突變的外顯子仍可擴(kuò)增成片段大小正常的產(chǎn)物，因此用DNA測(cè)序等非定量PCR方法不能檢測(cè)出。為了全面檢測(cè)DJ-1基因突變，國(guó)內(nèi)外普遍應(yīng)用定量PCR技術(shù)結(jié)合DNA測(cè)序技術(shù)

7、進(jìn)行DJ-1基因的突變檢測(cè)。 目的： 探討中國(guó)散發(fā)EOP患者DJ-1基因的突變頻率及臨床特點(diǎn)。 方法： 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)DJ-1基因外顯子重排突變，結(jié)合DNA直接測(cè)序技術(shù)檢測(cè)DJ-1基因點(diǎn)突變、小片段插入或/和缺失突變。 結(jié)果： 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)結(jié)合DNA直接測(cè)序技術(shù)對(duì)160例散發(fā)EOP患者進(jìn)行DJ-1基因突變檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)4例EOP患者存在DJ-1基因外顯子2的雜合缺

8、失突變，突變頻率為2.5％；發(fā)現(xiàn)4個(gè)已知多態(tài)IVS4+30T→G、IVS4+45 G→A、IVS4+46 G→A、IVS5+31G→A和一個(gè)新的多態(tài)IVS6+52C→T。未發(fā)現(xiàn)DJ-1特異性臨床特點(diǎn)。 結(jié)論： 1.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在中國(guó)散發(fā)EOP患者中發(fā)現(xiàn)1個(gè)新的DJ-1基因致病突變：2號(hào)外顯子雜合缺失突變； 2.發(fā)現(xiàn)DJ-1基因2號(hào)外顯子重排突變的突變頻率為2.5％，提示DJ-1基因外顯子重排突變對(duì)中

9、國(guó)散發(fā)性EOP的發(fā)病可能具有重要意義； 3.應(yīng)用DNA直接測(cè)序技術(shù)在中國(guó)散發(fā)EOP患者中檢測(cè)出4個(gè)已知的DJ-1基因單核甘酸多態(tài)和1個(gè)新的DJ-1基因單核甘酸多態(tài)（IVS6+52C→T）。 第三部分血清DJ-1蛋白濃度與PD相關(guān)性研究 背景： 帕金森病（Parkinson's disease，PD）的主要病理改變是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性變性壞死和路易小體形成，然而，PD的病理改變遠(yuǎn)早于臨床癥狀的出現(xiàn)

10、，且由于目前PD的早期診斷主要依賴于臨床癥狀，從而與原發(fā)性震顫、帕金森疊加綜合征、多系統(tǒng)萎縮、進(jìn)行性核上性麻痹及皮質(zhì)基底節(jié)變性等具有相似臨床癥狀的一些疾病很難鑒別。并且，在PD的診斷確立以后，仍存在對(duì)疾病的嚴(yán)重程度及進(jìn)展速度的判定問(wèn)題。此外，對(duì)于神經(jīng)保護(hù)藥物的應(yīng)用是否能延緩疾病的進(jìn)程以及延緩的速率都需要更直接、可靠的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)進(jìn)行評(píng)判。所有這些需求都引起了研究者對(duì)于PD的生物標(biāo)記的興趣。目前對(duì)于PD而言，生物標(biāo)記的應(yīng)用主要針對(duì)以下三方面：一

11、、對(duì)PD作出早期、正確的診斷；二、對(duì)PD嚴(yán)重程度及疾病進(jìn)展速度進(jìn)行評(píng)估；三、評(píng)價(jià)藥物的療效。 DJ-1蛋白在全身廣泛分布，并能在腦脊液及血漿、血清中被檢出。已有研究表明腦脊液或血漿、血清DJ-1蛋白濃度可能作為某些腫瘤、腦血管疾病及神經(jīng)變性疾病診斷及病程判斷的生物標(biāo)記。 目的： 檢測(cè)DJ-1蛋白在中國(guó)人群散發(fā)性PD患者血清中的表達(dá)水平，明確血清DJ-1蛋白濃度是否可作為PD診斷及病程判斷的生物標(biāo)記。 方

12、法： 應(yīng)用ELISA技術(shù)對(duì)120名散發(fā)PD患者及126名性別、年齡匹配的正常對(duì)照進(jìn)行血清DJ-1蛋白濃度的測(cè)定；應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)兩組測(cè)定值進(jìn)行比較分析。 結(jié)果： PD組（未分期）與對(duì)照組血清DJ-1蛋白濃度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.113）；PD組（Hoehn-Yahr分期）與對(duì)照組血清DJ-1蛋白濃度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.441）；PD組不同病程與對(duì)照組血清DJ-1蛋白濃度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p