人胚胎植入過程中細胞因子和生長因子的表達及IL-1β和HCG的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、本研究利用Luminex xMAP系統(tǒng)的優(yōu)點，同時研究母胎兩類細胞培養(yǎng)上清液中l(wèi)eptin、TGF-β1、IL-6、bFGF、IL-1ra、VEGF、EGF、IL-1α的蛋白表達量，研究人體正常情況下的胚胎植入的細胞和分子生物學機理，試圖尋找在人胚胎著床過程中同時起重要作用的關鍵性分子。并分別用IL-1β和HCG作為調(diào)節(jié)劑，研究它們在母胎兩類細胞環(huán)境中對胚胎植入和滋養(yǎng)細胞侵入如何進行調(diào)控，尋找控制胚胎著床的關鍵性特異分子，為妊娠的順利進

2、展提供更多的分子理論依據(jù)。 第一部分人早孕期滋養(yǎng)細胞和蛻膜細胞表達的細胞因子及生長因子的差異 【目的】 研究人早孕期絨毛外細胞滋養(yǎng)層細胞和蛻膜基質(zhì)細胞分泌的多種細胞因子和生長因子，探討影響胚胎植入的關鍵因子。 【方法】 1．按孕周收集人正常早孕絨毛和蛻膜標本，分別進行離體分離及培養(yǎng)。本實驗分為用0.125％胰蛋白酶和15IU/ml DNA酶，溫和消化絨毛組織；用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDT

3、A消化蛻膜組織，用2.5％-1.25％BSA純化絨毛外滋養(yǎng)層細胞和蛻膜基質(zhì)細胞，去除成纖維細胞、巨噬細胞等。得到的絨毛外滋養(yǎng)層細胞(extravillous cytotrophoblasts，EVCT)和蛻膜基質(zhì)細胞(decidualizedstromal cells，DSC)，按5×10<'5>/ml接種于分別鋪在24孔培養(yǎng)板中1ml無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，鑒定其純度在95％以上后，收集培養(yǎng)上清液。 2．倒置顯微鏡下觀察細胞生

4、長狀態(tài)，并拍照。 3．用SP免疫組化染色法鑒定細胞純度將無菌蓋玻片置于培養(yǎng)皿中進行細胞爬片培養(yǎng)，待細胞爬片基本長滿時，取出蓋玻片，PBS漂洗5min，3次，4％多聚甲醛4℃固定30 min，第一抗體分別為細胞角蛋白(CK7)和泌乳素(PRL)抗體，然后以鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶(streptavidin-peroxide，SP)染色法進行染色。加酶底物DAB、H<,2>O<,2>顯色，光學顯微鏡觀察，陽性細胞胞質(zhì)呈棕黃色。操

5、作按說明書進行，用PBS代替一抗做陰性對照。 4．利用Luminex xMAP技術測定EVCT組和DSC組培養(yǎng)上清液中8種細胞因子和生長因子：IL-1α、IL-1ra、IL-6、VEGF、TGF-β1、Leptin、bFGF、EGF的蛋白表達量。比較這些細胞因子在人正常早孕期絨毛外細胞滋養(yǎng)細胞與蛻膜基質(zhì)細胞中表達量的差異。 5．用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學處理，獨立樣本t檢驗比較EVCT組和DSC組細胞因子和生長因子

6、表達量的差異。顯著水平P<0.05。 【結果】 1．DSC及EVCT在24孔培養(yǎng)板正常生長，SP法免疫組化證實DSC的泌乳素(prolactin，PRL)表達陽性，細胞質(zhì)內(nèi)可見大量棕黃色顆粒；EVCT的角蛋白7(cytokeratin7，CK7)表達為陽性，細胞膜可見大量棕黃色顆粒。EVCT和DSC鑒定純度均在95％以上，且生物學特性得以維持，可以用來實驗。 2．EVCT培養(yǎng)上清液中，占優(yōu)勢的細胞因子的含量由高到

7、低依次是Leptin、TGF-β1、IL-6、bFGF、IL-1ra、VEGF、EGF、IL-1α。DSC培養(yǎng)上清液中，占優(yōu)勢的細胞因子的含量由高到低依次是Leptin、TGF-β1、bFGF、IL-1ra、L-6、EGF、IL-1α、VEGF。 3．EVCT和DSC分泌的細胞因子和生長因子的蛋白表達量，兩者之間除EGF外其他因子的表達量經(jīng)統(tǒng)計學處理有顯著性差異。獨立t檢驗結果顯示：除EGF外，IL-1α、IL-1ra、IL-6

8、、Leptin、VEGF、TGF-β1、bFGF差異均有統(tǒng)計學差異。 【結論】 人早孕期絨毛外滋養(yǎng)層細胞和蛻膜基質(zhì)細胞分泌Leptin、IL-6、bFGF、IL-1ra、EGF、VEGF、IL-1α、TGF-β1在早期妊娠中起著重要作用。兩者分泌的蛋白濃度不同。胎源性和母源性細胞分泌的細胞因子和生長因子可能存在互補性，以達到母胎之間細胞因子的平衡，有利于胚胎的著床。 第二部分重組人白介素1β對人早孕期滋養(yǎng)細胞和蛻

9、膜細胞分泌的細胞因子及生長因子的調(diào)節(jié)作用 【目的】 研究重組人IL-1 β對人早孕期絨毛外滋養(yǎng)層細胞和蛻膜基質(zhì)細胞分泌的細胞因子和生長因子的影響，探討其對這些因子的調(diào)節(jié)作用，以及對胚胎著床和胎盤形成的影響。 【方法】 1．DSC和EVCT 的體外培養(yǎng)方法及鑒定方法同前，于第一次換液時用1ml含10ng/ml IL-1β的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后收集上清液。 2．倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)。

10、 3．用SP免疫組化染色法進行細胞純度鑒定。(方法同第一部分3) 4．利用Luminex xMAP技術測定培養(yǎng)上清液中8種細胞因子和生長因子TGF-β1、EGF、IL-1α、IL-1ra、IL-6、bFGF、VEGF、Leptin的蛋白表達量。比較人早孕期絨毛外滋養(yǎng)層細胞與蛻膜基質(zhì)細胞表達的這些細胞因子在加入IL-1β前后蛋白表達量的變化。 5．用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學處理，配對樣本t檢驗比較EVCT組和DSC

11、組加入IL-1B前后細胞因子和生長因子表達量的差異，顯著水平P<0.05。 【結果】 1．DSC及EVCT在24孔培養(yǎng)板正常生長，細胞鑒定純度均在95％以上，可以用來實驗。 2．EVCT加入含調(diào)節(jié)因子IL-1β的培養(yǎng)液后收集的上清液，與EVCT空白組分泌的細胞因子和生長因子比較：IL-1α、Leptin、EGF表達量增加，而IL-1ra、IL-6、VEGF、TGF-β1、bFGF表達量減少。配對t檢驗結果顯示：I

12、L-1α、Leptin的增加具有統(tǒng)計學意義，IL-1ra、IL-6、TGF-β1、bFGF、VEGF的減少具有統(tǒng)計學意義。 3．DSC加入含調(diào)節(jié)因子IL-1β培養(yǎng)液后收集的上清液，與DSC空白組分泌的細胞因子和生長因子比較：IL-1ra、Leptin表達量減少，而IL-1α、IL-6、VEGF、TGF-β1、bFGF、EGF表達量增加，其中IL-1ra、IL-6、bFGF、VEGF、Leptin的改變具有統(tǒng)計學意義。配對t檢驗結

13、果顯示：IL-1ra、Leptin的增加有統(tǒng)計學意義，IL-6、VEGF、TGF-β1、bFGF的減少均有統(tǒng)計學意義。 【結論】 IL-1β與人早孕期絨毛外細胞滋養(yǎng)細胞和蛻膜基質(zhì)細胞分泌的各種因子的相互作用可能有利于胚胎植入和胎盤形成。 第三部分人絨毛膜促性腺激素對人早孕期滋養(yǎng)細胞和蛻膜細胞分泌的細胞因子及生長因子的調(diào)節(jié)作用 【目的】 研究人絨毛膜促性腺激素(HCG)對早孕期滋養(yǎng)層細胞和蛻膜基質(zhì)細

14、胞分泌的細胞因子和生長因子的影響，探討其促進胚胎著床的分子機制。 【方法】 1．收集人正常早孕絨毛和蛻膜標本，分別進行離體培養(yǎng)，鑒定其純度在95％以上。(方法同第一部分1)于第一次換液時用1ml含25U/ml人絨毛膜促性腺激素的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后收集上清液。 2．倒置顯微鏡下觀察各細胞生長狀態(tài)，并拍照。 3．用SP免疫組化染色法進行細胞純度鑒定。(方法同第一部分3) 4．利用Luminex

15、xMAP技術測定培養(yǎng)上清液中8種細胞因子和生長因子TGF-β1、EGF、IL-1α、IL-1ra、IL-6、bFGF、VEGF、Leptin的蛋白表達量。比較人早孕期絨毛外細胞滋養(yǎng)層細胞與蛻膜基質(zhì)細胞中這些細胞因子在加入HCG后表達量的變化。 5．用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學處理，配對樣本t檢驗比較EVCT組和DSC組加入HCG后細胞因子和生長因子表達量的差異，顯著水平P<0.05。 【結果】 1．EVCT與

16、DSC在24孔培養(yǎng)板正常生長，細胞鑒定純度在95％以上，可以用于后續(xù)實驗。 2．用人絨毛膜促性腺激素處理后，滋養(yǎng)細胞中IL-1α、VEGF、EGF表達量增加，而IL-1ra、IL-6、TGF-β1、FGF、Leptin表達量減少，其中IL-1α、IL-1ra、IL-6、VEGF、TGF-β1、Leptin、FGF的改變具有統(tǒng)計學意義。配對t檢驗結果顯示：IL-1α、VEGF、EGF的增加具有統(tǒng)計學意義，IL-1ra、IL-6、T

17、GF-β1、Leptin、bFGF的減少具有統(tǒng)計學意義。 3．用人絨毛膜促性腺激素處理后，蛻膜細胞中IL-1α、TGF-β1、Leptin、FGF表達量減少，而IL-1ra、IL-6、VEGF、EGF表達量增加，其中IL-1α、IL-1ra、IL-6、Leptin、FGF的改變具有統(tǒng)計學意義。配對t檢驗結果顯示：IL-1α、Leptin、，bFGF、TGF-β1的增加具有統(tǒng)計學意義，IL-1ra、IL-6、VEGF、EGF的減少