IK細胞因子在牛植入前胚胎和牛胎兒成纖維細胞中的表達及作用.pdf

1、細胞因子IK(IKcytokine)是Ⅱ類主要組織相容性復合物(majorhistocompatibilitycomplex，classⅡ，MHCⅡ)下調因子，該基因編碼的蛋白因含有多個精氨酸(arginine，R)、谷氨酸(glutamicacid，E)和天冬氨酸（asparticacid，D）殘基重復序列又名RED蛋白。MHCⅡ分子只在抗原提呈細胞（antigen-presentingcell，APC）中表達，如巨噬細胞、B細胞、已

2、活化的T細胞、樹突細胞等;在不表達MHCⅡ分子的非抗原提呈細胞中，多種細胞因子，如干擾素γ（interferonγ，IFNγ）可誘導MHCⅡ分子的表達。細胞因子IK的功能就是抑制MHCⅡ分子在非抗原提呈細胞中的誘導性表達，對維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)定具有重要作用。
　　本研究通過mRNA差異顯示PCR方法(mRNAdifferentialdisplayreversetranscriptionpolymerasechainreaction，m

3、RNADDRT-PCR)發(fā)現ik在牛植入前胚胎發(fā)育不同時期差異表達，實時定量PCR(quantitativereal-timePCR，qPCR)結果顯示在生發(fā)泡期卵母細胞(germinalvesicle，GV)、第二次減數分裂中期卵母細胞（secondmeioticmetaphase，MⅡ）和2細胞期胚胎中，ik表達量隨發(fā)育階段進展而下調;達到8細胞胚胎期，其表達量上調，并且達到植入前各發(fā)育階段中表達量高峰;隨后再次下調，到囊胚期時的表

4、達水平低于MⅡ期。據此確定細胞因子ik是一個牛植入前胚胎發(fā)育差異表達基因。用IK特異性抗體對體外受精合子、2細胞期、8細胞期胚胎、桑椹胚及囊胚的免疫熒光染色結果顯示，IK在8細胞期前的發(fā)育階段中無蛋白表達，從8細胞期開始在細胞核內有少量蛋白表達，至桑椹胚期各細胞核內均有IK蛋白表達，囊胚中滋養(yǎng)外胚層和內細胞團細胞核中均有其蛋白表達。對受精后0h受精卵進行小干擾RNA（smallinterferenceRNA，siRNA）胞質顯微注射干擾

5、ik表達，并以注射等量發(fā)育液的胚胎為對照組，qPCR檢測注射后24h的2細胞胚胎期干擾效率為79％(P＜0.01)。統(tǒng)計干擾組與對照組胚胎發(fā)育率，發(fā)現細胞因子ik在受精卵期的下調可降低卵裂率和8細胞胚胎率(P＜0.05)，而對囊胚率則無顯著影響(P＞0.05)。進一步的qPCR顯示，在注射后48h的8細胞胚胎期，ik表達量顯著上升，且干擾組與正常發(fā)育組胚胎中的表達量無顯著差異(P＞0.05);囊胚期干擾組胚胎中的ik表達量為正常發(fā)育組胚

6、胎中表達量的0.74倍(P＜0.01)。對ik干擾的2細胞期胚胎、8細胞期胚胎和囊胚進行免疫熒光染色，染色結果與正常發(fā)育胚胎無差別。這表明，在8細胞胚胎期發(fā)生的合子基因組激活(zygotegenomeactivation，ZGA)活化了ik基因的轉錄，新合成的mRNA補充了卵母細胞的ikmRNA儲備，對siRNA誘導的沉默進行了補償;到囊胚期，ik轉錄減弱，siRNA的干擾效果得以顯現。
　　在8細胞期胚胎期前的發(fā)育階段，胚胎中雖

7、然有ikmRNA表達但并沒有蛋白表達，然而在這期間干擾ikmRNA導致卵裂率和8細胞胚胎率降低，這表明在這期間可能有免疫熒光染色檢測不到的少量IK蛋白表達，并且這少量的IK蛋白對卵裂和8細胞胚胎發(fā)育有重要作用。而在8細胞期胚胎中ikmRNA表達量達到高峰并開始有大量蛋白表達，說明ik在8細胞胚胎期有重要作用。由于這些大量表達的mRNA影響了之前siRNA的干擾作用而檢測不到干擾效果，因此囊胚發(fā)育未受到影響。
　　qPCR對ik下游

8、基因牛Ⅱ類組織相容性復合物bola-drb3(Bostaurusmajorhistocompatibilitycomplex，classⅡ，DRB3)及Ⅱ類組織相容性復合物反式活化蛋白ciita(classⅡ，majorhistocompatibilitycomplex，transactivator)的檢測結果顯示bola-drb3與ciita在GV期、MⅡ期和2細胞胚胎中的mRNA表達量均維持較低水平，而在8細胞期均提高表達且達到峰值

9、，在囊胚中mRNA表達量均降低至與8細胞胚胎前期的表達水平。對ik干擾組胚胎bola-drb3和ciita的qPCR結果顯示在2細胞期、8細胞期胚胎和囊胚中，兩基因的mRNA表達量均有降低。用CIITA特異性抗體對體外受精2細胞期、4細胞期、8細胞期胚胎、桑椹胚及囊胚和siRNA干擾ik表達的8細胞期胚胎、桑椹胚及囊胚的免疫熒光染色結果顯示CIITA在植入前各階段胚胎中均沒有蛋白表達。說明干擾ik表達不會引起胚胎MHCⅡ表達失調。

10、>　　綜上所述，在牛植入前胚胎中ik的表達受到嚴格的調控，不容易受到外源干擾RNA影響，對維持植入子宮時期MHCⅡ分子在胚泡表面不表達或低表達具有重要作用。
　　用實時定量PCR檢測細胞因子ik在牛胎兒成纖維細胞中的表達發(fā)現其豐度較高，而ciita和bola-drb3沒有表達，同時有研究證明ik在Hela細胞中具有激活紡錘體組裝檢驗點(spindleassemblycheckpoint，SAC)的功能，因此為了確定細胞因子IK在牛

11、胎兒成纖維細胞中的功能是否與SAC相關，本實驗檢測了ik過表達和干擾表達對SAC成員mad1、mad2及cdc20表達的影響。結果表明干擾ik表達并不影響SAC成員的mRNA表達水平，而過表達ik則會顯著提高SAC關鍵組分mad2和cdc20的mRNA表達。推斷ik對SAC的作用可能不是必要條件而是充分條件，即ik低表達不會抑制SAC功能，但其高表達可以促進SAC功能。
　　本研究從牛胚胎發(fā)育和牛胎兒成纖維細胞兩個方面檢測細胞因子