衰老對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響及內(nèi)在機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分內(nèi)皮細(xì)胞傳代過程中形態(tài)學(xué)及細(xì)胞周期的變化及其關(guān)系 目的：探討血管內(nèi)皮細(xì)胞傳代中的形態(tài)學(xué)變化及細(xì)胞周期的變化及其關(guān)系，應(yīng)用TNF-α刺激對(duì)細(xì)胞衰老的進(jìn)一步影響。 方法：體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，通過傳代及應(yīng)用TNF-α干擾形成細(xì)胞的衰老模型。光鏡及電鏡下觀察細(xì)胞衰老及未衰老的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：血管內(nèi)皮細(xì)胞傳代過程中隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐步退化。在代齡較低的細(xì)胞，生長(zhǎng)速度較快。光

2、鏡下觀察可見胞漿清澈透明，核清晰，核分裂相多見，細(xì)胞相互嵌合，為單層呈鋪路石狀排列。透射電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，偽足較少。胞核呈圓形或卵圓形，核被膜略有曲折。線粒體數(shù)量多而密集；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)多呈密集平行排列的扁束池狀；染色質(zhì)核內(nèi)分布均勻。衰老細(xì)胞生長(zhǎng)速度降低，分裂相少見。光鏡下觀察細(xì)胞排列稀疏，胞核清晰，大小不均，胞漿混濁，難于形成單層細(xì)胞，最終細(xì)胞自然脫壁懸浮死亡。電鏡下細(xì)胞形態(tài)多樣，體積縮小，偽足眾多。細(xì)胞質(zhì)致密，胞核明顯不規(guī)則，出現(xiàn)

3、核裂、曲核，核染色質(zhì)濃集，邊集于核被膜內(nèi)側(cè)，而核內(nèi)其他部位的染色質(zhì)趨于消失。線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量明顯減少，并且相當(dāng)數(shù)量的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、積水樣變。代齡較低的細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，處于S期的細(xì)胞明顯多于傳代及加用TNF-α后的同代細(xì)胞。細(xì)胞增值指數(shù)由25.82±1.83降至11.46±2.28。傳代末期，細(xì)胞生長(zhǎng)趨于停滯，死亡細(xì)胞增加。各代次細(xì)胞之間增值指數(shù)的差別有顯著性意義。應(yīng)用TNF-α刺激的內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞周期變化更為明顯，細(xì)胞增值指數(shù)明顯降

4、低。 結(jié)論：衰老內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯變化。細(xì)胞器相應(yīng)減少且細(xì)胞活性降低，抵抗外界有害因子能力降低，更新減慢。 第二部分衰老對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1表達(dá)的影響 目的：探討血管內(nèi)皮細(xì)胞在復(fù)制性衰老過程中MCP-1mRNA表達(dá)的變化；TNF-α干預(yù)對(duì)MCP-1mRNA表達(dá)的進(jìn)一步影響。 方法：體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，選取第2、4、6、8代細(xì)胞融合達(dá)80％以上，應(yīng)用胰蛋白酶消化分離。采用TRIZOL一步法

5、提取細(xì)胞RNA。應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞MCP-1mRNA的表達(dá)。干預(yù)組同樣選取第2、4、6、8代細(xì)胞，生長(zhǎng)融合達(dá)80％以上后，加用40ng/mlTNF-α24小時(shí)，同上檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MCP-1mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：MCP-1mRNA的表達(dá)在細(xì)胞傳代前期中，隨著代齡的增加而增加。傳代末期，隨著代齡的增加，其表達(dá)逐漸降低。應(yīng)用TNF-α刺激的VEC，其MCP-1mRNA表達(dá)顯著增加，且隨著細(xì)胞代齡的增加而增加。在傳代末期，細(xì)胞功能退

6、化，分泌功能明顯降低，受到刺激后分泌功能下降也較為顯著。 結(jié)論：傳代初期，細(xì)胞狀態(tài)良好，無外界刺激的情況下，細(xì)胞分泌MCP-1較少。但是在傳代過程中，單核細(xì)胞趨化因子-1隨著傳代的進(jìn)展而分泌增加，在細(xì)胞完全老化之后，分泌功能降低，MCP-1分泌明顯降低。應(yīng)用TNF-α刺激后，內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1mRNA表達(dá)顯著增加，分泌MCP-1隨之增加。說明TNF-α可刺激其在體外培養(yǎng)的VEC表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)單核細(xì)胞向內(nèi)皮下趨化和遷移。上述過程反

7、映了細(xì)胞分泌功能隨著細(xì)胞衰老而發(fā)生的變化。 第三部分細(xì)胞衰老過程中線粒體膜電位與活性氧變化關(guān)系及其意義 目的：探討細(xì)胞線粒體膜電位及細(xì)胞內(nèi)活性氧變化在EC衰老中的變化規(guī)律和意義。 方法：體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，選取第2、4、6、8代細(xì)胞融合達(dá)80％以上，應(yīng)用胰蛋白酶消化分離。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位、細(xì)胞內(nèi)活性樣的變化。對(duì)于第2、4、6、8代細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80％以上后，加用40ng/mlTNF-α24小

8、時(shí)，用胰蛋白酶消化分離后進(jìn)行細(xì)胞周期、線粒體膜電位、細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè)。 結(jié)果：(1)隨著傳代的增加，線粒體膜電位也發(fā)生明顯的變化。線粒體膜電位逐漸下降。應(yīng)用TNF-α刺激的內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位下降更為顯著。(P＜0.05)。(2)第二代細(xì)胞中的活性氧含量較低。隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞內(nèi)的活性氧含量逐漸增加，至代齡較高的細(xì)胞，胞內(nèi)活性氧減少。各代次細(xì)胞含活性氧之間差別有顯著意義。應(yīng)用TNF-α刺激的低代齡內(nèi)皮細(xì)胞ROS增加更為顯著