羊布魯菌BCSP31蛋白的表達(dá)、純化及其單克隆抗體的制備和鑒定.pdf

1、布魯菌是引起人獸共患布魯菌病的病原菌。布魯菌有7個(gè)生物種型，其中羊、牛、豬三個(gè)種既可感染家畜也可以感染人類。布魯菌可通過多種途徑感染人和動(dòng)物，致病性強(qiáng)，流行范圍廣，危害十分嚴(yán)重。此外，布魯菌還是一種潛在的生物戰(zhàn)劑。
　　布魯菌病臨床癥狀輕重不一，個(gè)體表現(xiàn)差異大，容易誤診，治療不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致病情遷延，影響人畜健康并導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失。此外，現(xiàn)有的布魯菌檢測(cè)方法仍不理想，存在特異性不高，不能區(qū)分疫苗免疫和自然感染，容易誤診和漏診。隨著近年來布魯

2、菌病日益增高的流行趨勢(shì)，發(fā)展快速敏感特異的檢測(cè)方法對(duì)控制布魯菌病疫情，及時(shí)處置病畜、治療患者有重要意義。
　　布魯菌細(xì)菌表面31kDa蛋白BCSP31具有抗原性強(qiáng)、在不同種間同源性高的特點(diǎn)。本研究擬通過純化BCSP31蛋白，制備其單克隆抗體（mAb），為建立布魯菌病ELISA檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。
　　1.主要方法
　　將質(zhì)粒pGEX-4T-1-BCSP31轉(zhuǎn)化至大腸桿菌并誘導(dǎo)表達(dá)，采用GST親和層析純化的方法，分別獲得G

3、ST-BCSP31融合蛋白和BCSP31純化蛋白。用純化的BCSP31蛋白免疫小鼠，將小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤Sp2/0細(xì)胞融合，ELISA間接法篩選陽性克隆，3次克隆化后建立雜交瘤細(xì)胞系。采用小鼠腹腔接種雜交瘤細(xì)胞制備腹水，正辛酸－硫酸銨法純化mAb。采用Western-blot、ELISA以及表位相加試驗(yàn)等方法鑒定mAb特性。建立用于檢測(cè)布魯菌感染血清的ELISA間接夾心法。
　　2.主要結(jié)果
　　GST-BCSP31融合蛋白

4、在25℃誘導(dǎo)時(shí)為可溶性表達(dá)，經(jīng)親和層析純化，分別獲得GST-BCSP31融合蛋白2.48mg/mL和BCSP31純化蛋白0.5mg/mL；Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示所獲蛋白可與兔抗布魯菌血清特異性反應(yīng)。獲得2株雜交瘤細(xì)胞系，1F1和1E5，均為IgG1亞類；2株mAb均可與羊布魯菌BCSP31蛋白特異性反應(yīng)，而不與HCVAS3蛋白、結(jié)核分枝桿菌DAF44a蛋白和RPF蛋白、漢坦病毒GP和NP以及人IgG1等無關(guān)蛋白反應(yīng)，也不與

5、大腸桿菌裂解液反應(yīng)，表明這兩株mAb具有較高的特異性。并且這兩株mAb在BCSP31蛋白上的抗原位點(diǎn)不同；mAb1F1與BCSP31蛋白的相對(duì)親和力高于1E5。ELISA間接夾心法的工作條件是以10μg/mL包被mAb，包被量為100μl/孔；抗原最佳濃度為20μg/mL，加入量為100μl/孔；HRP-羊抗兔最佳工作濃度為1:50000，加入量為100μl/孔。對(duì)相應(yīng)參數(shù)進(jìn)行評(píng)估，特異性、敏感性及重復(fù)性均良好。
　　BCSP31