PRDⅩⅢ在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及RNAi誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討PRDXⅢ在不同級別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平以及在膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡中的作用。 方法：收集65例膠質(zhì)瘤和10例正常腦組織標(biāo)本，利用免疫組織化學(xué)方法檢測PRDXⅢ蛋白表達(dá)水平，利用Tunel法檢測細(xì)胞凋亡指數(shù)。收集29例膠質(zhì)瘤和9例正常腦組織標(biāo)本，利用RT-PCR法檢測PRDXⅢmRNA的表達(dá)水平，分析不同級別膠質(zhì)瘤及腦組織相互間PRDXⅢ表達(dá)水平的差異以及與細(xì)胞凋亡指數(shù)間的關(guān)系。設(shè)計(jì)合成針對PRDXⅢ的siRNA，脂質(zhì)體介導(dǎo)

2、轉(zhuǎn)染人U251多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，RT-PER法檢測轉(zhuǎn)染后24小時(shí)PRDXⅢmRNA的表達(dá)水平，Western-blotting檢測轉(zhuǎn)染后48小時(shí)PRDXⅢ蛋白的表達(dá)水平，篩選出有效的干擾序列；流式細(xì)胞儀、DNAladder、PI染色檢測轉(zhuǎn)染后48小時(shí)U251細(xì)胞的凋亡狀況，MTI、檢測轉(zhuǎn)染后48小時(shí)U251細(xì)胞的生長抑制率。 結(jié)果：PRDXⅢ蛋白在正常腦組織、Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中表達(dá)陽性率分別為2/10(2

3、0％)、4/14(28.6％)、6/19(31.6％)、10/13(76.9％)、和16/19(84.2％)，Ⅲ級和Ⅳ級膠質(zhì)瘤PRDXⅢ蛋白表達(dá)陽性率明顯高于正常腦組織和Ⅰ級、Ⅱ級膠質(zhì)瘤。隨病理級別增高，PRDXIII蛋白表達(dá)強(qiáng)度也明顯增加(r=0.576，p=0.00)。正常腦組織、Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的凋亡指數(shù)分別為24.51±3.27％、18.90±2.69％、16.46±2.‘74％、9.90±3.17％和7.6

4、6±2.83％，隨著膠質(zhì)瘤級別的增高，凋亡指數(shù)逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=74.45，P=0.00)。在正常腦組織和膠質(zhì)瘤中，PRDXⅢ蛋白表達(dá)陽性組的凋亡指數(shù)為10.29±4.87％，PRDXⅢ蛋白表達(dá)陰性組為19.07±4.64％，PRDXⅢ蛋白表達(dá)陽性組的凋亡指數(shù)明顯低于PRDXⅢ陰性組(t=7.99，P=0.00)。正常腦組織、Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中PR.DXIIImRNA產(chǎn)物OD值與內(nèi)參照B-actinOD值的比

5、值分別為0.48±0.12、 0.69±0.22、0.96±0.24和0.97±0.36，隨著膠質(zhì)瘤級別的增高，比值逐漸增高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.17，P=0.00)。RT-PCR檢測示，空白對照組、空載體組和無關(guān)序列組PRDXⅢmRNA表達(dá)無明顯變化，干擾序列1、3使PRDXⅢmRNA的表達(dá)明顯降低，尤以干擾序列3的效果最顯著，對PRDXⅢmRNA表達(dá)的抑制率為76％。WesternBlotting結(jié)果顯示，空白對照組、空載

6、體組和無關(guān)序列組PRDXⅢ蛋白表達(dá)無明顯變化，干擾序列1、3對PRDXⅢ蛋白表達(dá)有明顯抑制作用，以干擾序列3作用最顯著，抑制率達(dá)到63.9％。DNA ladder 顯示干擾組出現(xiàn)明顯梯形電泳條帶，說明有較明顯的細(xì)胞凋亡，空白對照組，空載體組和無關(guān)序列組細(xì)胞未見明顯梯形電泳條帶。PI染色結(jié)果顯示空白對照組，空載體組和無關(guān)序列組細(xì)胞未見明顯凋亡，而干擾組細(xì)胞核的染色質(zhì)高度濃染，部分細(xì)胞核裂解為碎塊，符合凋亡形態(tài)學(xué)的改變。FCM檢測結(jié)果顯示空

7、白對照組、空載體組、無關(guān)序列組和干擾組細(xì)胞凋亡率分別為2.26±0.64％、2.68±0.74％、3.54±0.62％和35.9±4.85％，干擾組細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對照組、空載體組、無關(guān)序列組(P=O.00)。MTT檢測干擾組對U251細(xì)胞生長的抑制率為44.4％，明顯減慢了細(xì)胞生長。 結(jié)論:PRDXⅢ在膠質(zhì)瘤中高度表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度隨著腫瘤級別的增高而增加，Ⅲ、Ⅳ級膠質(zhì)瘤中PRDXⅢ表達(dá)的強(qiáng)度明顯高于Ⅰ，Ⅱ級膠質(zhì)瘤和正常腦組