人巨細(xì)胞病毒感染對(duì)U251膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖分化及凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　1.探討不同感染復(fù)數(shù)（MOI）的人巨細(xì)胞病毒（HCMV）在體外對(duì)U251膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（GSCS）增殖、分化及凋亡的影響。
　　2.用MOI為1的HCMV AD169毒株感染U251GSCS，觀察HCMV對(duì)U251GSCS在裸鼠大腦內(nèi)成瘤及血管生成的影響。
　　方法：
　　1.用HCMV AD169毒株感染人胚肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增，收集上清并用空斑定量法檢測(cè)病毒滴度。
　　2.用單克隆培養(yǎng)法從

2、U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中分離出GSCS，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)U251GSCS中表達(dá)CD133的細(xì)胞數(shù)。
　　3.用MOI分別為0.2、1、5的HCMV感染U251GSCS。分別在感染后12h、24h、36h、48h時(shí)間點(diǎn)，用MTT法檢測(cè)U251GSCS增殖情況。
　　4.在HCMV感染后48h，用RT-PCR檢測(cè)U251GSCS中IE-1 mRNA、Bcl-2 mRNA及Bax mRNA的表達(dá)。用Western blot檢測(cè)U251

3、GSCS中IE-1、Bcl-2、Bax和CD133蛋白的表達(dá)。
　　5.將MOI為1的HCMV感染U251GSCS，然后接種到10只裸鼠顱內(nèi)，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組；對(duì)照組接種未感染HCMV的U251GSCS。觀察裸鼠生長(zhǎng)情況及外觀變化。
　　6.處死瀕死裸鼠，取出腦組織并分理出腫瘤組織做HE染色。用免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織中IE-1、CD34蛋白的表達(dá)。
　　7.采用weidner血管計(jì)數(shù)法計(jì)算出實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組腫瘤微血管密度（MV

4、D）。
　　結(jié)果：
　　1. U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，U251GSCS中CD133陽(yáng)性細(xì)胞比例達(dá)98.00%。
　　2. MTT結(jié)果顯示，用MOI為1和5的HCMV感染U251GSCS12h、24h、36h、48h后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖活性顯著增加（P＜0.05）。而用MOI為0.2的HCMV感染U251GSCS12h、24h、36h、48h后，與對(duì)照組比較，細(xì)胞增殖活性差異

5、不明顯（P＞0.05）。
　　3. RT-PCR結(jié)果顯示，HCMV（MOI=1，5）感染U251GSCS48h后，細(xì)胞IE-1 mRNA、Bcl-2 mRNA的表達(dá)上調(diào)，Bax mRNA表達(dá)下調(diào)，與對(duì)照組比較，差異顯著（P＜0.05）。而用MOI為0.2的HCMV感染U251GSCS48h后，細(xì)胞IE-1 mRNA、Bcl-2mRNA及Bax mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（P＞0.05）。
　　4. Western b

6、lot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HCMV（MOI=1，5）感染U251GSCS48h后，細(xì)胞IE-1、Bcl-2及CD133蛋白表達(dá)增多，而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）。
　　5.接種感染HCMV（MOI=1）的U251GSCS3周后，大部分裸鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少、皮膚皺縮和一些神經(jīng)癥狀。
　　6.移植瘤HE染色顯示，腫瘤細(xì)胞核異形明顯。免疫組化結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HCMV（MOI=1）感染的U251GSCS移植瘤IE

7、-1表達(dá)陽(yáng)性。
　　7. weidner血管計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，HCMV（MOI=1）感染的U251GSCS移植瘤微血管密
　　度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.一定滴度的HCMV感染U251GSCS可促進(jìn)其增殖，使其維持干性特征。
　　2. HCMV感染U251GSCS后，細(xì)胞表達(dá)IE-1并通過(guò)下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)和上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)來(lái)抑制U251GSCS凋亡。
　　3. HC