重組分泌型sTRAIL腺病毒的構(gòu)建及其誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建表達(dá)分泌型腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)基因的重組腺病毒載體,并導(dǎo)入U251腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞,檢測重組腺病毒sTRAIL誘導(dǎo)的U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡及其與細(xì)胞周期的關(guān)系。
　　 方法：采用PCR技術(shù)從人肝臟cDNA文庫中擴(kuò)增出編碼114-281位氨基酸的TRAIL基因片段。將擴(kuò)增的TRAIL插入含有分泌性信號肽IL-2的腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-IL-2中,命名為pAdTraek-CMV-IL-2

2、-TRAIL。pAdTrack-CMV-IL-2-TRAIL經(jīng)PmeI線性化后,電轉(zhuǎn)化入轉(zhuǎn)化了pAdEasy-1的BJ5183細(xì)胞。篩選重組腺病毒質(zhì)粒pAd-sTRAIL。經(jīng)HEK293細(xì)胞包裝后得到復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad-sTRAIL,氯化銫密度梯度離心純化Ad-sTRAIL病毒,并測定病毒滴度。采用RT-PCR法和westernblotting分別檢測目的基岡的表達(dá)。細(xì)胞培養(yǎng)并用重組腺病毒sTRAIL感染U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞,光鏡及

3、熒光顯微鏡下觀察U251細(xì)胞的形態(tài)變化及轉(zhuǎn)染成功率,免疫熒光技術(shù)檢測sTRAIL感染U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞后在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),MTT法檢測sTRAIL對U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用特點(diǎn),流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期,并判斷二者的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：純化后的Ad-sTRAIL病毒滴度為3.12×1015pfu/L。經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出104bp的基因片段。Weternblot檢測劍目的基因在U251細(xì)胞的表達(dá)。感染了Ad-sTRA

4、IL的U251細(xì)胞在TRAIL的表達(dá)和產(chǎn)生過程中增殖能力受到抑制并出現(xiàn)明顯的凋亡,流式細(xì)胞術(shù)檢測示G0/G1期、S期細(xì)胞比例與對照組相比明顯降低,出現(xiàn)較高的亞二倍體峰。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了重組分泌型sTRAIL腺病毒載體Ad-sTRAlL,可高效感染U251細(xì)胞并表達(dá)sTRAIL;Ad-sTRAIL可誘導(dǎo)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡:在一定范圍內(nèi),隨病毒濃度增加或作用時間延長,瘤細(xì)胞存活率降低;sTRAIL作用于U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞