B7-1單克隆抗體對小鼠狼瘡樣腎病防治作用的研究.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種常見的系統(tǒng)性自身免疫性疾病,主要表現(xiàn)為T、B淋巴細(xì)胞功能異常,產(chǎn)生多種自身抗體(以抗核抗體和抗雙鏈DNA抗體最為重要)和免疫復(fù)合物,炎癥可累及全身,造成關(guān)節(jié)、皮膚、腎臟、心、肺、血管等各臟器和組織不可逆的慢性破壞和功能喪失,最終影響生命。其中狼瘡性腎炎(lupus nephritis,LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡最常見和最嚴(yán)重的并發(fā)癥,是導(dǎo)致SLE患者死亡

2、的主要原因之一。B7-1分子屬于免疫球蛋白超家族成員之一,與表達(dá)T細(xì)胞表面的相應(yīng)受體CD28／CTLA-4結(jié)合產(chǎn)生共刺激信號,介導(dǎo)T細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)；若缺乏此共刺激信號,T細(xì)胞將進(jìn)入無能(anergy)或耐受狀態(tài),甚至死亡。應(yīng)用B7抗體可以阻斷B7分子與CD28／CTLA-4的相互作用,進(jìn)而阻斷共刺激信號的傳遞,引起抗原特異性的無反應(yīng)性或反應(yīng)低下。由此可見,通過阻斷B7-CD28／CTLA-4共刺激通路有望為自身免疫性疾病、移植排斥、

3、腫瘤免疫等疾病提供新的診斷和治療方法。本課題運用降植烷(2,6,10,14-tetramethylpentadecane,Pristane)建立與人類SLE相似的小鼠動物模型,并研究B7-1單克隆抗體對狼瘡樣腎病的治療作用,為闡明SLE的發(fā)病機(jī)制和B7-1單克隆抗體在臨床中的潛在應(yīng)用價值提供了理論依據(jù)。本研究分為三個部分：
　　 第一部分：B7-1單克隆抗體的制備及鑒定。
　　 目的：獲得B7-1單克隆抗體純品并分析鑒定

4、其生物學(xué)特性,為治療小鼠狼瘡樣腎病提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 方法：運用本科室成功建立的穩(wěn)定分泌B7-1單克隆抗體的細(xì)胞株4E5,采用體內(nèi)誘生腹水法制備單抗；ProteinG免疫親和層析法純化抗體；流式細(xì)胞術(shù)方法分析單抗對細(xì)胞膜型B7-1分子的識別。
　　 結(jié)果：經(jīng)體內(nèi)誘生腹水法制備單抗,小鼠腹水形成陽性率約為85％,腹水收獲量平均為3ml／只小鼠；經(jīng)免疫親和層析法純化,腹水中抗體蛋白的得率為3mg／ml；單抗4E5與細(xì)胞株D

5、audi、Raji、H1299以及小鼠脾臟細(xì)胞的陽性結(jié)合率分別為88.6％、95.7％、20.6％、48.5％。
　　 第二部分：狼瘡樣腎病小鼠模型的建立及生物學(xué)鑒定。
　　 目的：構(gòu)建C57BL／6J狼瘡樣腎病鼠模型,探討環(huán)境因素Pristane在SLE發(fā)病機(jī)制中的重要作用。
　　 方法：8周齡雌性C57BL／6J小鼠30只隨機(jī)分為兩組,造模組予一次性腹腔注射Pristane0.5ml／只,對照組予一次性腹腔注

6、射生理鹽水0.5ml／只。注射后第5、10天用流式細(xì)胞術(shù)方法(FCM)分別檢測脾臟中吞噬細(xì)胞(M9)、樹突狀細(xì)胞(DC)的活化以及B細(xì)胞表面分子的變化情況；每月定期檢測血清中抗核抗體(ANA)、抗雙鏈DNA抗體(dsDNA)及尿蛋白；7個月時處死小鼠,通過常規(guī)HE染色方法觀察小鼠腎臟病理改變以及直接免疫熒光方法檢測腎臟免疫復(fù)合物(IC)的沉積情況。
　　 結(jié)果：小鼠腹腔注射Pristane后第5、10天,脾臟中的Mψ、DC均有不

7、同程度活化(p<0.05),B細(xì)胞表面CD21、CD86、MHC-Ⅱ等分子表達(dá)也不同程度上調(diào)(p<0.05)；4個月時,造模組小鼠血清中ANA和抗dsDNA抗體的陽性率分別約為80％和89％；7個月時,78％小鼠出現(xiàn)蛋白尿(≥+),腎臟HE切片顯示腎臟出現(xiàn)腎小球腫脹,淋巴細(xì)胞浸潤等典型的腎臟病理改變,IC沉積。而對照組小鼠血清中ANA、抗dsDNA抗體陰性,未見蛋白尿,腎臟組織未見病理改變。本實驗結(jié)果顯示,Pristane成功誘導(dǎo)了C5

8、7BL／6J狼瘡樣腎病鼠模型,為進(jìn)一步研究狼瘡的干預(yù)措施提供了實驗對象。
　　 第三部分：B7-1單克隆抗體對小鼠狼瘡樣腎病治療作用的研究。
　　 目的：探討B(tài)7-1單克隆抗體阻斷B7-1／CD28信號通路對小鼠狼瘡樣腎病的治療作用。
　　 方法：將8周齡雌性C57BL／6J小鼠隨機(jī)分為3組,正常對照組給予生理鹽水0.5ml／只,造模組與治療組給予Pristane0.5ml／只,同時分別給予鼠同型IgG抗體(造模

9、組)或B7-1單克隆抗體(治療組)200μg／只。第10天分別檢測淋巴結(jié)和脾臟中Mψ、DC的活化及脾臟B細(xì)胞表面活化分子的變化:每月定期檢測血清中ANA及尿蛋白；7個月時處死小鼠,HE染色觀測腎臟病理變化和冰凍切片直接免疫熒光法觀察免疫復(fù)合物的沉積情況。
　　 結(jié)果：第10天,與正常對照組相比,治療組和造模組小鼠淋巴結(jié)和脾臟中Mψ、DC均有不同程度的活化,治療組活化程度明顯低于造模組(p<0.05),脾臟B細(xì)胞表面CD21、CD

10、40、CD86等分子上調(diào)程度低于造模組(p<0.05)；4個月時治療組和造模組小鼠血清均檢測到ANA,但治療組的血清抗體滴度低于造模組(p<0.05)；治療組7個月時,尿蛋白含量低于造模組,腎臟HE結(jié)果顯示治療組小鼠腎臟病理改變輕于造模組,直接免疫熒光檢測可見治療組免疫復(fù)合物熒光強度弱于造模組,正常對照組小鼠腎臟沒有明顯的病理改變。本實驗結(jié)果顯示,B7-1單克隆抗體對小鼠狼瘡樣腎病具有良好的治療效果。
　　 結(jié)論：⑴B7-1單克